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第一部分 肌萎缩侧索硬化的DNA甲基化特征目的:本研究旨在通过比较散发性肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis,ALS）患者和健康对照（health control,HC）全血样本的DNA甲基化特征,探索DNA甲基化在ALS发病中的作用。方法:共纳入2020年12月至2021年5月期间在我院神经科门诊就诊的临床确诊、临床拟诊、实验室支持-临床拟诊的散发性ALS患者32例作为病例组,选择同时期陪同患者就诊的健康家属作为对照组。采集两组的人口学资料和临床资料。记录患者的诊断级别、起病年龄、起病部位、病程、ALSFRS-R（Revised ALS Functional Rating Scale）评分、King分期和反映早期疾病进展的Δ ALSFRS-R。采集外周全血,提取样本中的基因组DNA后,进行亚硫酸盐转化和NaOH变性,对基因组DNA进行片段化和用随机内切酶酶切扩增产物,最后与Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片杂交、单碱基延伸及染色。芯片扫描读取数据后进行相关的生物信息学分析。结果:与HC组相比,ALS组存在34个差异甲基化位点（differentially methylated position,DMP）,其中5个DMP呈现高甲基化,29个DMP呈现低甲基化。这些DMP注释到13个基因,其中高甲基化的基因2个,分别是ATAD3B和BLK;低甲基化的基因 11 个,分别是DDO、IQCE、ABCB1、DNAH9、FIGN、NRP1、TMEM87B、CCSAP、ST6GALNAC5、MYOM2和RUSC1-AS1。与 HC 组相比,ALS 组存在 12个差异甲基化区域（differentially methylated region,DMR）,注释到12个基因,分别是 NWD1、LDHD、C1S、IQCE、TNF、PDE1C、LGALS1、CSNK1E、LRRC23、ENO2、ELOVL2和ELOVL2-AS1。根据 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes数据库的信息,DNAH9和TNF参与了 ALS的通路。相关性分析发现ELOVL2的甲基化水平和起病年龄呈显著正相关（r=0.86,adjust P=0.001）,ARID1B的甲基化水平和病程呈显著正相关（r=0.83,adjust P=0.01）。但是,并没有发现任何甲基化位点和ALSFRS-R评分或者ΔALSFRS-R显著相关。ALS组的整体甲基化水平和HC组无显著差异（P＞0.05）。结论:本研究发现了与ALS相关的DMP基因和DMR基因,提示诸如DNAH9和TNF的低甲基化等表观遗传学改变在ALS的病因中起到了重要作用,为从表观遗传学角度揭示ALS的发病机制提供了新的线索。未来的研究应着重关注这些DMP基因和DMR基因,并在更大样本量的队列中进行验证,为寻找新的治疗靶点奠定基础。第二部分 肌萎缩侧索硬化的转录组特征和DNA甲基化的关联目的:本研究通过转录组测序对第一部分研究中的肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis,ALS）患者和健康对照（heathy control,HC）外周血 mRNA 表达水平进行测定,旨在寻找两组间差异表达的基因和相应的功能。结合前期DNA甲基化研究的结果,寻找差异表达基因（differentially expressed gene,DEG）和差异甲基化基因（differentially methylated gene,DMG）之间的联系,为验证候选基因奠定基础。方法:研究对象是第一部分研究中的12例ALS患者和12例HC。使用PAXgene Blood RNATube采血管收集研究对象的外周血,提取总RNA后进行建库测序。在完成数据质控后,将clean reads与人的参考基因组比对,对基因表达水平进行定量,以FoldChange大于1.2,P值小于0.05为筛选标准进行差异分析,对差异基因进行富集分析和基因集的富集分析。对本研究中的DEG和第一部分研究中的DMG取交集,并利用实时荧光定量PCR（quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）对交集基因的表达水平进行验证。结果:与HC组相比,在ALS患者外周血中筛选到DEG1001个,其中表达上调的基因629个,表达下调的基因372个。这些基因富集于多条可能与ALS相关的通路,其中氧化应激的通路、核糖体和线粒体两个细胞器相关的通路值得关注。DEG和DMG 的交集基因分别为 LGALS1、TNF、LDHD和RUSC1-AS1。qRT-PCR 证实 ALS患者外周血LGALS1mRNA表达水平较HC组明显升高。结论:转录组测序结果揭示了 ALS患者外周血的转录组特征和DNA甲基化的关联。DEG和DMG的交集基因LGALS1可能是值得进一步深入研究的候选基因。第三部分 LGALS1基因启动子区甲基化与肌萎缩侧索硬化的相关性研究目的:本研究通过对肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis,ALS）患者和健康对照（healthy control,HC）外周血中LGALS1基因启动子区的甲基化水平进行测定,旨在寻找该基因DNA甲基化和ALS的相关性。同时,对LGALS1编码的蛋白galectin-1在外周血中的表达含量进行检测,比较两组间的差异,并探索LGALS1基因启动子区甲基化对外周血galectin-1表达的影响。方法:本研究纳入45例ALS患者和32例HC,入组时留取外周血样本。利用亚硫酸盐处理后测序（bisulfite sequencing PCR,BSP）对LGALS1基因启动子区1个CpG岛中的12个CpG位点进行检测,主要流程包括基因组DNA的提取、亚硫酸盐转化、TA克隆和测序,用甲基化率表示每个CpG位点的甲基化水平。同时,通过酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELIS A）检测外周血galectin-1的含量。比较ALS组和HC组之间CpG位点甲基化水平的差异,并分析每个CpG位点甲基化水平与ALS患者临床特征的相关性。同时,比较ALS组和HC组外周血galectin-1表达水平的差异,并分析LGALS1基因启动子区甲基化水平和外周血galectin-1表达水平的相关性。结果:在LGALS1基因启动子区的 CpG 岛中,CpG1、CpG3、CpG4、CpG5、CpG7、CpG8、CpG9、CpG11和CpG12位点的甲基化水平在ALS组显著低于HC组,差异有统计学意义（P＜0.001;P＜0.001;P=0.001;P=0.004;P＜0.001;P＜0.001;P＜0.001;P＜0.001;P＜0.001）。ALS组12个CpG位点总体甲基化水平显著低于HC组,差异有统计学意义（P＜0.001）。ALS组外周血galectin-1水平显著高于HC组,差异有统计学意义（P=0.007）。在ALS组和HC组,LGALS1基因启动子区总体甲基化水平与galectin-1表达水平呈负相关（r=-0.571,P＜0.001）。与起病年龄≤45岁的ALS患者相比,起病年龄＞45岁的ALS患者在CpC3、CpG4、CpG7和CpG11位点的甲基化水平以及12个CpG位点的总体甲基化水平均显著降低（P=0.006;P=0.041;P=0.003;P=0.013;P＜0.001）。CpG1、CpG7、CpG11 和 CpG12位点的甲基化水平及12个CpG位点的总体甲基化水平均与起病年龄显著负相关（P=0.020;P＜0.001;P=0.025;P=0.044;P=0.001）。结论:LGALS1基因启动子区在ALS中呈低甲基化,其编码的蛋白galectin-1在ALS患者外周血中高表达,且其甲基化水平与疾病的起病年龄呈负相关。本研究揭示了LGALS1基因启动子区甲基化和ALS的相关性,为未来进行深入的机制研究奠定了基础。