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牦牛是青藏高原的典型反刍家畜代表,在青藏高原畜牧业可持续发展和人类食品供给中发挥着至关重要的作用。瘤胃是牦牛的关键消化代谢器官,其中栖息的复杂多样微生物与机体的健康及生产性能紧密相关。前期研究已证明牦牛瘤胃微生物总体的菌群结构组成和优势的细菌菌群。然而,根据瘤胃生理和营养素代谢特点,瘤胃微生物可分为不同的生态位微生物:固体颗粒饲料粘附、液相及瘤胃腹囊和背囊上皮粘附微生物。但目前有关牦牛不同生态位微生物群落结构的组成与变化规律,牦牛与其它反刍家畜瘤胃不同生态位瘤胃微生物的差异,及牦牛瘤胃不同生态位微生物的功能等仍不清楚。因此,本研究选取5头（4岁）的雌性牦牛为研究对象,基于16S-r RNA基因测序,系统分析比较了牦牛瘤胃不同生态位微生物菌群与功能,主要包括牦牛瘤胃固相、液相和上皮粘附细菌群落结构研究、牦牛与黄牛瘤胃固相、液相和上皮粘附细菌比较研究;最后基于宏基因组的分析结果,对牦牛瘤胃固相与液相微生物功能进行了进一步研究。1.我们收集了五头雌性牦牛的瘤胃固相、液相、背囊和腹囊上皮附着微生物样本,然后扩增细菌16S r RNA基因V4区域并使用Illumina Mi Seq平台对其进行测序。主坐标分析检测到牦牛瘤胃液相、固相和上皮附着细菌群落有显著差异,并且腹囊和背囊上皮附着细菌细菌群落也存在显着差异。Rikenellaceae RC9,Lachnospiraceae,Ruminococcaceae,以及Fibrobacter spp.是牦牛瘤胃固相组中显著富集的细菌,而Prevotella和Prevotellaceae UCG 003在液相组中显著富集。Campylobacter spp.,Comamonas spp.,Desulfovibrio spp.,Solobacterium spp.在背囊上皮组中相对丰度更高,而Howardella spp.,Prevotellaceae UCG 001、Ruminococcaceae UCG 005和Treponema 2在腹囊上皮组中富集。牦牛瘤胃固相、液相、腹囊上皮部位之间的预测功能特征的比较也显示出显著差异。牦牛瘤胃固相细菌的氨基酸代谢通路、酶家族和能量代谢通路相对丰度显著高于液相;牦牛瘤胃液相细菌异型生物质降解和代谢通路相对丰度显著高于固相。牦牛瘤胃背囊上皮细菌细胞运动和膜转运相对丰度显著高于腹囊细菌;牦牛瘤胃腹囊上皮粘附细菌的碳水化合物代谢,酶家族,萜类和多酮类化合物的代谢和外源性物质的生物降解相对丰度高于固相、液相和背囊上皮细菌。以上研究结果证明,牦牛瘤胃固相,液相和上皮粘附细菌的组成、预测功能与数量有显著差异。2.我们下载了已发表的黄牛瘤胃固相、液相、腹囊上皮附着细菌的16S r RNA基因V4区域扩增子测序数据,与我们测序得到的牦牛瘤胃固相、液相、腹囊上皮附着细菌16S r RNA基因V4区域扩增子测序数据联合分析,结果显示牦牛瘤胃腹囊上皮附着细菌与黄牛瘤胃上皮附着细菌多样性没有显著差异。比较牦牛和黄牛OTUs,发现黄牛与牦牛瘤胃细菌群落多数是共享的,黄牛瘤胃每个生态位特有的OTU数量小于牦牛。黄牛固相和液相相对丰度最高的门都是Bacteroidetes,其次为Firmicutes和Fibrobacteres（纤维杆菌门）。黄牛腹囊上皮相对丰度最高的门是Firmicutes,然后是Bacteroidetes和Fibrobacteres。而牦牛固相、液相、腹囊上皮附着细菌相对丰度最高的门都为Firmicutes其次为Bacteroidetes。牦牛与黄牛瘤胃结构显著不同,且瘤胃不同部位细菌结构显著不同。Lachnoclostridium 10,Lachnospiraceae FCS020 group,Lachnospiraceae UCG006等在牦牛固相中相对丰度更高的细菌与纤维素降解、VFA生成相关,Prevotellaceae UCG-003,Eubacterium coprostanoligenes group,Ruminococcaceae UCG-010等在牦牛液相中相对丰度更高的细菌纤维素、可溶性糖降解相关。Treponema 2,Prevotellaceae UCG-001,Ruminococcaceae UCG-005在牦牛腹囊上皮中相对丰度更高,与疾病、免疫炎症相关。牦牛和黄牛不同生态位细菌功能存在显著差异。不完全还原的三羧酸循环通路、饱和脂肪酸延伸、三羧酸循环V通路在牦牛固相组相对丰度更高。牦牛液相中相对丰度更高的通路有:嘧啶核苷从头生物合成的超途径、饱和脂肪酸延伸。牦牛腹囊上皮中相对丰度更高的通路仅有1个,是嘌呤核苷酸从头生物合成的超途径II通路;以上结果表明牦牛瘤胃固相粘附细菌密度和多样性比黄牛固相粘附细菌密度和多样性都低。并且牦牛瘤胃液相附着细菌多样性也低于黄牛瘤胃液相附着细菌。此外,牦牛瘤胃腹囊上皮附着细菌与黄牛瘤胃上皮附着细菌多样性没有显著差异。牦牛瘤胃固相与黄牛瘤胃固相以及牦牛瘤胃与黄牛瘤胃液相间相对丰度差异很大的细菌都与碳水化合的消化和挥发性脂肪酸的产生相关。牦牛瘤胃腹囊与黄牛瘤胃腹囊组相对丰度差异显著的细菌与宿主免疫,身体健康相关。3.本试验采集牦牛瘤胃固相和液相样品,提取微生物基因组DNA,Illumina Hi Seq进行de novo测序。本研究共获得了486.29Gb高质量的clean reads。基于NR库预测到23576687个非冗余开放阅读框（ORFs）。对基因集进行物种分类,固相和液相中主要细菌都是Bacteroidetes和Firmicutes。组装分箱得到342个中等质量的MAGs。其中固相中110个,液相中305个,其中小于20%在物种水平有分类信息。并且得到10个近乎完整的细菌基因组,其中固相组得到5个近乎完整的基因组,液相组得到10个近乎完整的细菌基因组。这些基因组80%以上都在已有数据库中没有找到,可能是新的物种。基因组编码的碳水化合物在固相组和液相组丰度排名前两位的都是糖苷水解酶类和糖基转移酶类,在固相组和液相组都占80%以上。在固相组,属于Fibrobacterota门的基因组平均每个基因组编码的碳水化合物消化酶数量最多,其次是Bacteroidota门的基因组。液相组平均每个基因组编码的碳水化合物消化酶数量最多的基因组属于Firmicutes门,其次是Fibrobacterota门。因此固相组和液相组主要的消化纤维素、木质素及果胶的酶类相同,但编码碳水化合物消化酶的细菌丰度在固相和液相间存在差异。综上所述,本研究结果证明,牦牛瘤胃不同生态位细菌群落结构有显著差异,牦牛与黄牛瘤胃不同生态位细菌组成显著不同,固相组和液相组主要的消化纤维素、木质素及果胶的酶类相同,但编码碳水化合物消化酶的细菌丰度在固相和液相间存在差异。以上结果对于理解牦牛瘤胃微生物群落与功能提供了新的认知,为提高牦牛瘤胃微生物的调控及生产性能的提升提供了理论支撑。