研究背景海马（hippocampus）是参与学习记忆形成、空间编码和情绪调节等过程的重要脑区,具有储存短期记忆、长期记忆以及空间定位等功能。海马包括CA1、CA2、CA3和齿状回（dendate gyrus,DG）等亚区,其中由颗粒神经元组成的DG约占海马构成体积的25%-30%。多项研究表明,DG颗粒细胞（DG granule cells,DGCs）的树突和形成的突触结构异常与人类和小鼠的学习记忆改变有关。此外,DG亦能通过颗粒神经元将相似的输入发射模式转化为不同的输出发射模式,从而区分相关记忆调节模式分离。哺乳动物（包括人类）中证实DG在整个生命周期内能产生新的神经元,许多不同的m RNA和蛋白质在DG中特异地表达。选择性调节特定分子在海马区域的表达,是解析海马相关认知功能机制的重要研究策略。瞬时受体电位通道（transient receptor potential channels,TRPCs）介导钙离子内流,是一种与膜上6个跨膜区相关的渗透性、非选择性阳离子通道。作为细胞局部环境变化的传感器,TRPCs具有多种功能,包括机械感知和味觉感知以及维持离子稳态。TRPCs家族的成员（TRPC1-TRPC7）已经根据氨基酸序列被鉴定出来,并被分为四个家族,这些通道亚单位具有多种细胞功能。研究表明,TRPCs在中枢神经系统（central nervous system,CNS）中广泛表达,并且对从神经元生长、突触发育、神经元分化等基本细胞事件至关重要。在TRPCs中,越来越多的证据表明TRPC6通道蛋白正在成为通过调节突触形成而参与认知功能的一个重要靶点。TRPC6主要定位于近端树突和轴突,参与脑源性神经营养因子（BDNF）介导的生长锥调节、神经元存活和树突形成。苔藓纤维突触重构与TRPC6表达下调密切相关。TRPC6通过Ca2+/Camodrin依赖的蛋白激酶IV和c AMP反应元件结合蛋白（Ca MKIV-CREB）依赖的途径促进神经元树突的生长。在发育早期,特别是在神经元活性较低的阶段,TRPC6在神经元树突的生长中发挥关键作用。TRPC6蛋白富集在突触体和突触后部分,且主要集中在突触后部分。已证实TRPC6对兴奋性突触的形成至关重要,TRPC6过量表达可增加树突棘密度的发现进一步证实了这一点。临床资料及动物实验结果显示:TRPC6通道的功能障碍可能引发广泛的以认知功能障碍为特征的中枢神经系统相关疾病,如阿尔茨海默氏病（alzheimer’s disease,AD）、癫痫、自闭症谱系障碍（autism spectrum disorder,ASD）和脑血管病。TRPC6在海马的锥体神经元、DGCs和一些胶质细胞中表达,其中TRPC6敲减可导致癫痫状态后DGCs的大量退变。在脑缺血条件下,神经元中TRPC6发生降解,恢复TRPC6表达水平可明显改善神经元存活。我们课题组研究以及临床数据发现,ASD中TRPC6基因的破坏会导致神经元发育、形态和功能的异常。在AD模型小鼠中亦证实TRPC6的表达异常,而其具体原因仍需进一步阐明。这些研究资料提示基于调控海马DG区域TRPC6表达水平的策略,研究对海马认知功能影响的可行性及必要性。腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）是一种高效的基因传递载体系统,其作为质粒穿梭载体具有安全性高、宿主范围广、表达稳定、免疫原性低、物理性质稳定等优点。短发夹RNA（short hairpin RNA,sh RNA）亦作为一种被广泛应用的基因调控工具,在核酸酶作用下剪切成双链si RNA与胞内靶m RNA位点结合,促使其降解。目前已有多项研究证实TRPC6异常参与认知障碍类疾病的病理发生,然而海马DG区域TRPC6分子敲减影响认知功能的途径和细胞学机制缺乏相应的系统研究对其阐明。因此,本研究拟通过AAV介导的sh RNA敲减小鼠海马TRPC6表达的模型,进一步研究TRPC6表达降低影响海马认知功能及调控机制和相关分子信号通路。研究方法:构建AAV2/9-H1-sh RNA（TRPC6）-CAG-EGFP（sh RNA-TRPC6）以及AAV-CMV-EGFP（sh RNA-control）病毒。选取雄性C57BL/6J（C57）小鼠（6-8周龄,22-28g）,适应饲养环境一周后,随机分为两组:（i）sh RNA-control组,（ii）sh RNA-TRPC6组。分别将sh RNA-TRPC6和sh RNA-control病毒通过立体定位仪按照以下坐标:AP=-1.9;ML=±1.1;DV=-2.0注射入小鼠两侧海马DG内,使用汉密尔顿针以0.1μL/min的速度注射(1μL,7.5×1012病毒颗粒/m L)。待小鼠恢复及病毒表达4周后,进行相关实验。分别收集两组小鼠大脑灌注标本,通过比较免疫荧光染色观察结果,评估sh RNA-TRPC6与sh RNA-control两组小鼠大脑冰冻切片海马区域病毒表达部位、TRPC6表达强度,以明确病毒效果。通过实时定量荧光聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）技术和免疫印迹实验（western blot,WB）,比较两组小鼠新鲜海马组织中TRPC6蛋白以及其同源家族蛋白TRPC3的表达差异。通过行为学方法检测两组小鼠的海马认知功能相关行为。通过高尔基染色观察sh RNA-TRPC6与sh RNA-control两组小鼠海马DG颗粒神经元树突形态、树突棘数量及分型。通过免疫印迹技术比较突触相关蛋白在两组小鼠海马表达差异。在注射病毒4周后收集sh RNA-TRPC6与sh RNA-control两组小鼠新鲜海马组织,通过转录组测序（RNA-seq）及q RT-PCR技术,比较sh RNA-TRPC6与sh RNA-control两组小鼠海马差异表达基因（DEGs）,通过富集聚类分析探索TRPC6敲减对小鼠海马认知功能障碍行为发生可能的机制。最后,通过WB实验比较两组小鼠海马组织中调控认知功能的通路蛋白表达水平。病毒持续表达8个月,进行相关检测。通过行为学方法检测两组小鼠海马认知功能相关行为。通过q RT-PCR技术,比较sh RNA-TRPC6与sh RNA-control两组小鼠海马TRPC6 m RNA水平。研究结果:1.小鼠海马注射AAV敲减TRPC6效果的检测（1）绿色GFP荧光显示,AAV在注射后第4周成功转染到两组小鼠海马DG中且均匀分布。通过TRPC6免疫荧光标记结果,发现与sh RNA-control小鼠相比,sh RNA-TRPC6病毒转导后,DG区域TRPC6的表达显著降低。其结果表明病毒注射部位及作用效果符合预期。（2）sh RNA-TRPC6组小鼠海马TRPC6在m RNA表达水平上显著降低（P＜0.05）,且同源家族蛋白TRPC3 m RNA表达水平无统计学差异。在病毒表达8月后,仍观察到sh RNA-TRPC6组小鼠海马TRPC6在m RNA表达水平下降。（3）与sh RNA-control组相比,sh RNA-TRPC6组小鼠海马TRPC6蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。2.海马TRPC6缺失导致小鼠认知功能障碍和对DG颗粒神经元树突棘及海马内突触蛋白的影响（1）筑巢试验用来检测海马体介导的认知能力。结果显示,病毒注射4周后sh RNA-TRPC6组小鼠表现出筑巢评分结果明显低于sh RNA-control组小鼠（P＜0.001）,而病毒注射8个月后,两组小鼠之间筑巢评分结果仍有统计学差异（P＜0.05）。（2）Y迷宫实验可反映小鼠海马的工作记忆能力。研究发现,与sh RNA-control组小鼠相比,sh RNA-TRPC6组小鼠存在明显的缺陷,自发交替的正确率较低（P＜0.01）。工作记忆能力的缺陷在sh RNA-TRPC6病毒注射8月后仍存在（P＜0.05）。（3）新物体识别（novel object recognition,NOR）实验可反映小鼠的短期记忆能力,其中采用识别系数（recognition rate,RR）对小鼠探索新旧物体时间比较评估。结果显示,两组小鼠在物体辨别方面的结果相似,表明DG区域TRPC6的表达减少对短期记忆没有影响,在病毒注射8月后两组小鼠识别系数无统计学差异。（4）三箱社交实验检测DG中TRPC6表达下调对小鼠社交性和社会认知能力的影响。结果显示,sh RNA-TRPC6组小鼠表现出明显的社交再认能力缺陷。在物体-小鼠阶段,两组小鼠的社交表现没有统计学差异,表明DG区域TRPC6敲减对小鼠的社交能力没有影响。在新-旧小鼠测试中,sh RNA-TRPC6组小鼠表现出花费相同的新-小鼠箱体探索时间,而sh RNA-control组明显偏好于新同种小鼠。病毒注射8月后研究发现:sh RNA-TRPC6组小鼠表现出异常的社交能力,但在社交识别能力方面均表现出缺陷。（5）开放旷场实验（open field test,OFT）可反映小鼠的运动能力,其中中央区域停留时间可反映焦虑水平。结果显示,sh RNA-TRPC6组小鼠的运动距离明显多于sh RNA-control组小鼠（P＜0.001）,而sh RNA-TRPC6组小鼠在中心区域停留时间较sh RNA-control组小鼠显著减少（P＜0.05）。（6）水迷宫（morris water maze,MWM）用于研究下调海马DG中TRPC6表达对小鼠长期空间学习记忆的影响。在学习阶段,sh RNA-TRPC6组小鼠在第5天（第5天:P＜0.05）的逃避潜伏期明显长于sh RNA-control组小鼠。测试阶段结果显示,两组小鼠花费相似的时间在目标象限。此外,sh RNA-control组小鼠在目标象限和对侧象限停留的时间有明显的差异（P＜0.05）。在穿越平台的次数上两组小鼠没有观察到差异（P＞0.05）。在测试过程中,sh RNA-TRPC6处理的小鼠比sh RNA-control组的小鼠的总游泳距离显著增加（P＜0.05）。在逆向水迷宫训练中,两组小鼠的三天逃逸潜伏期时间没有差异。在第11天的测试中,结果显示,sh RNA-control组小鼠在相反的象限停留的时间更多,总游泳距离没有差异。（7）高尔基染色结果显示:DG中TRPC6表达下调对小鼠颗粒神经元树突棘密度和成熟度产生显著影响。sh RNA-TRPC6组小鼠DG颗粒神经元树突棘密度较sh RNA-control组小鼠显著降低（P＜0.01）。根据树突棘的形态进行亚型分析,我们进一步发现,sh RNA-TRPC6组小鼠DG颗粒神经元未成熟细长型及成熟蘑菇状树突棘较sh RNA-control组小鼠显著减少（P＜0.05）,而sh RNA-TRPC6组小鼠DG颗粒神经元中间短粗型树突棘对比同批处理的sh RNA-TRPC6组小鼠也有下降趋势（P=0.052）。（8）通过WB实验进一步检测发现,与sh RNA-control组小鼠相比较,sh RNA-TRPC6组小鼠海马内PSD95蛋白表达明显降低（P＜0.01）,而两组小鼠海马内突触素（synapsin）和突触蛋白（synaptophysin）的表达水平无显著差异。3.海马DG中TRPC6敲减导致小鼠认知功能障碍的机制探讨（1）sh RNA-TRPC6组小鼠及sh RNA-control组小鼠海马新鲜送检样本质检结果均较好,组间基因表达情况存在差异。（2）转录组测序结果显示,与sh RNA-control组小鼠海马相比较,sh RNA-TRPC6组小鼠海马内共有755个DEGs,其中415个为上调表达基因,340个为下调表达基因。选取6个差异表达程度靠前的基因进行q RT-PCR验证,结果显示这些基因的表达趋势与转录组测序结果基本一致。（3）GO通路富集分析结果显示:DEGs主要富集于突触成分及突触传递功能密切相关的通路。在生物过程分类中,富集差异显著前五的通路包括参与定位、系统发育、多细胞生物过程的调节、突触传递、突触信号传导。在细胞成分分类中,富集差异显著前五的通路包括突触、细胞外基质、突触部分、细胞外空间和细胞外区域。（4）差异表达基因KEGG通路富集分析结果表明,大部分DEGs在钙信号通路、PI3K-Akt信号通路、磷脂酶D信号通路、Fox O信号通路和Rap1信号通路上均显著富集,PI3K-Akt信号通路已被证明与细胞存活和突触发育相关。使用WB实验进一步验证发现,sh RNA-TRPC6组小鼠海马中p Akt/Akt及其靶蛋白CREB的蛋白水平较sh RNA-control组小鼠显著降低（P＜0.05）。研究结论:本研究表明:使用AAV介导的sh RNA将海马DG区域TRPC6敲减时,小鼠的空间学习、工作记忆和社会识别记忆受损,同时导致颗粒神经元树突棘形态及成熟度受损,TRPC6通过调控PI3K-Akt信号通路影响突触功能,从而证实TRPC6表达减少与认知能力受损之间存在关联。