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目的 建立小鼠触须游离器官培养模型，并用该模型研究不同浓度他克莫司(FK506)对小鼠触须游离毛囊器官培养的生物学特性影响；用阿糖胞苷(Ara-c)结合小鼠触须游离毛囊器官培养模型建立化疗药物引起毛囊损伤的离体模型；再用该离体模型研究FK506与米诺环素(minocycline)对Ara-c引起的毛囊损伤的保护作用。采用体外培养的乳鼠背部皮肤毛囊球部细胞植入支架，试图建立含毛囊或毛囊样结构的人工皮肤替代物。 材料与方法 (一)动物来源 C57BL／6J近交系小鼠，周龄4～6周：C57BL／6J近交系乳浙江大学2004届硕士学位论文鼠，出生4d，均由浙江大学实验动物中心提供。 (二)实验方法 1、小鼠触须游离毛囊器官培养模型的建立: 用显微解剖的方法分离得小鼠触须毛囊，用WilliamS’E无血清培养液进行游离毛囊器官培养，并与以OMEM为主要成分的常规培养液培养的游离毛囊进行比较。观察两种方法培养对毛囊生长速度，毛囊总生长长度的影响。 2、FK506对小鼠触须毛龚体外培养生物学特性的研究: 用我们建立的小鼠触须游离毛囊器官培养模型，我们观察了不同浓度FKSO6对小鼠触须毛囊体外生长速度、总生长长度、体外生长维持时间等生物学指标做了观察，同时用加一TdR掺入法检测了FKSO6对毛囊D、A合成的影响。 3、Ara一c引起毛囊损伤离体模型的建立: 用我们建立的小鼠触须游离毛囊器官培养模型，我们观察了Ara一c处理/1h后小{改变;鼠触须毛囊体外生长速度、总生.长长度、体外生长维持时间等生物学指标的并用泊一TdR掺入法检测了Ar孔一c对毛囊ONA合成的抑制情况。 4、FKSO6对Ara一c引起的离体毛囊损伤的保护及逆转作用: 用我们建立的Ara一c引起毛囊损伤离体模型进行研究。分别在暴露Ara一c前Zh或暴露Ara一c后4h开始向培养液内加入FK506，观察了FKSO6对用Ara一c处理4h后的小鼠触须毛囊体外生长速度、总生长长度、体外生长维持时间等生物学指标抑制的干预作用;并用’H一TdR掺入法检测了FK506对由Ara一c引起的毛囊DNA合成抑制的干预作用。 5、米诺环素对Ara一c引起的离体毛囊损伤的保护作用: 用我们建立的Ara一c引起毛囊埙伤离体模型进行研究。在暴露Ara一c前2h开始向培养液内加入米诺环素，观察了米诺环素对Ara一C处理4h后的小鼠触须毛囊体外生长速度、总生长长度、体外生长维持时间等生物学指标抑制的干预作用。用两步酶消化法(0.5%分离酶，0.2%工型胶原酶)分离得出生4d乳鼠背部皮肤毛囊球部细胞，进行体外培养。MTT法检测米诺环素对Ara一c处理4h后毛囊球部细胞存活率降低的干预作用。 6、毛囊球部细胞体外在胶原/壳聚糖多孔支架上形成含毛囊皮肤样结构的研究: 用滴加法或注射法将体外培养的C57BL/6J近交系乳鼠背部皮肤毛囊球部细 浙江大学2004届硕士学位论文胞以不同传代数，不同细胞密度接种至胶原/壳聚糖多孔支架，倒置显微镜下观察支架表面或浅层细胞的生长或毛囊形成状况。将支架经10%甲醛固定后作FlE染色检查，观察支架表面及内部细胞的分布形态，并用免疫组织化学法检测高、低分子角蛋白及Vimentin的表达。月共聚焦激光扫描显微镜观察支架内活细胞的生长，以及形成毛囊或毛囊样结构的形成。弓庄旦1器口二刁、 1、小鼠触须游离毛囊器官培养模型的建立 显微解剖的方法分离得小鼠触须毛囊，用wi 1 1 iams’E无血清培养液(添加牛胰岛素IOmg/L、氢化考的松10“‘:/L、HEPES IOrnfnol/L、亚硒酸钠10协g/L、转铁蛋白10mg/L、青霉素IOOU几、链霉素100协g/L等)培养可以成功建立小鼠触须游离毛囊器官培养模型。离体培养的小鼠触须毛囊生长主要集中在前3一4天，以后毛囊生长速度明显减慢。用wi 11iams’E无血清培养液培养的毛囊前4d生长速度，总生长长度，体外生长维持时间等指标均优于常规培养液培养的毛囊(产入(0.05)。 2、FK506对小鼠触须毛囊体外培养生物学特性的研究 0.01一0.3 mg/L浓度的FK506能使体外培养的毛囊生长维持时间延长(尸<0.05):0.003一0.3 mg/L的FK506，前4d日平均生长速度、毛囊总生长长度以及同位素掺入率均优于空白对照组(尸<0.05)。0.003一0.3mg/L的FKSO6使毛囊的同位素:，H一TdR掺入率增高(作二0.05)。当FK506浓度达到lmg/L时，毛囊生长时间已无明显延长，前4d平均生长速度，毛囊总生长长度以及同位素掺入率与对照组己无显著差异。当FK506浓度达到3mg/L时，明显缩短毛囊的生长时间(尸<0.05)，前4d平均生长速度，毛囊总生长长度以及同位素掺入率显著降低(尸<0.05)。适当浓度的FK506可以延迟体外培养的小鼠触须毛囊球部形态由生长期向退行期转变。 3、Ara一c引起毛囊损伤离体模型的建立 IOmg/L与50mg/L的Ara一c明显缩短毛囊在体外的生长时间(尸<0.001)和总生长长度(尸<0.001)，抑制3H一TdR的掺入率“仗0.001)，Ara一c明显抑制