胸膜肺炎放线杆菌外毒素ApxIVA的翻译后修饰及其生物学活性研究

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由胸膜肺炎放线杆菌(APP)感染所引起的猪传染性胸膜肺炎(PCP)是一种高度接触性的呼吸道传染病。该病可造成猪的大量死亡,给全球养猪业带来了严重的经济损失。Apx外毒素是APP最重要的致病因子,APP能产生四种外毒素:ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ。其中前三种毒素的活性依赖于由apxⅠC、apxⅡC和apxⅢC编码的脂肪酸酰基化相关蛋白,而ApxⅣ的活性及活化机制缺乏研究,其上游基因orf1编码的蛋白可能参与ApxⅣ的活化。本研究选取ApxⅣ的结构蛋白ApxⅣA为研究对象,对其翻译后修饰的生物学活性进行了研究,取得了如下结果:  1.ApxⅣA的表达纯化:通过同源重组法构建原核表达重组质粒pET-apxⅣA、pET-orf1-apxⅣA、pET-apxⅠC-apxⅣA和pET-apxⅡC-apxⅣA,并分别对不同翻译后修饰条件下的重组蛋白ApxⅣA、ORF1-ApxⅣA、ApxⅠC-ApxⅣA和ApxⅡC-ApxⅣA进行表达纯化。  2.ApxⅣA溶血活性的鉴定:本试验分别采用绵羊红细胞和猪红细胞对ApxⅣA的溶血活性和协同溶血效应(CAMP)进行了研究,结果表明,ApxⅣA、ApxⅠC-ApxⅣA和ApxⅡC-ApxⅣA都没有溶血活性,仅ORF1-ApxⅣA表现出协同溶血效应和较弱的溶血活性,且对猪红细胞的溶血活性略强于对绵羊红细胞的溶血活性。说明,在与ORF1共表达时,ApxⅣA才表现出溶血活性。  3.ApxⅣA对SJPL细胞活性的影响:用重组蛋白ApxⅣA、ApxⅣA、ORF1-ApxⅣA、ApxⅠC-ApxⅣA和ApxⅡC-ApxⅣA分别处理SJPL细胞,结果表明,ORF1-ApxⅣA能显著降低SJPL细胞的活性,这一作用随ORF1-ApxⅣA浓度的降低而减弱;且ORF1-ApxⅣA对SJPL细胞的生长有抑制作用,并能使SJPL细胞发生皱缩和裂解。说明,在与ORF1共表达时,ApxⅣA对SJPL细胞的生长、形态及活性产生影响。  4.ApxⅣA对SJPL细胞凋亡的影响:用ORF1-ApxⅣA处理SJPL细胞,对SJPL细胞进行FITC、PI双荧光染色,并通过流式细胞仪检测凋亡情况。结果表明,ORF1-ApxⅣA不能诱导SJPL细胞发生凋亡。
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