一、研究背景以及研究目的　　 结直肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，近年来发病率和死亡率均呈现逐年上升趋势。转移是导致结直肠癌患者死亡的主要原因之一，阐明结直肠癌的分子转移机制以及控制肿瘤转移成为当前的主要研究方向;同时寻找结直肠癌侵袭转移相关的生物学标记，为药物作用靶点提供理论基础。　　 最近Formins家族蛋白作为细胞骨架的结构组建和装配的关键调控分子引起人们的广泛关注，FMNL2是最近发现的一个Diaphanous相关的formins(DRFs)亚家族成员，在前期实验中，我们通过基因芯片生物信息学发现FMNL2与结直肠癌转移相关，可能作为一个研究结直肠癌侵袭以及转移新的潜在靶点。随后的实验证明FMNL2在结直肠癌中与淋巴结的转移相关，但与癌组织的浸润深度、分化、肿瘤的位置无关，可能是通过影响细胞运动促进结直肠癌侵袭和转移。朱曦龄博士沉默FMNL2基因后，发现结直肠癌细胞的体外生长、运动、侵袭及体内肝转移能力都受到抑制，同时与细胞运动相关的RhoA/ROCK信号通路蛋白的表达均降低，认为FMNL2参与Rho信号转导通路;随后Kitzing等应用siRNA技术屏蔽15种人Formin因子，发现FMNL2是选择性的与有活性的RhoC反应，则认为FMNL2是RhoC的下游靶效应子。　　 肝再生磷酸酶3(PRL3)是新近发现的一种具有促进细胞生长、浸润和迁移的蛋白酪氨酸磷酸酶，属于蛋白质酪氨酸磷酸酶家族成员。近年来研究发现，它与多种肿瘤的侵袭转移密切相关，但其引发肿瘤转移和增强浸润能力的作用机制尚不明确。Fiordalisi等研究体外结直肠癌细胞系SW480，发现PRL3高表达能够引起结肠癌SW480细胞株小GTP酶活性改变，其中RhoA和RhoC表达增加4至5倍，Rac活性降低70％左右，对Cdc42没有影响，表明Rho家族蛋白是PRL3相关信号通路的下游元件。　　 综上所述，FMNL2、RhoC以及PRL3在肿瘤组织高表达，与肿瘤转移密切相关，涉及肿瘤转移过程多个方面。综合文献FMNL2和Rho蛋白之间存在怎样的调控关系？FMNL2参与Rho细胞运动信号通路的哪个作用环节？FMNL2和PRL3蛋白之间是否存在调控关系？FMNL2与哪些靶蛋白发生相互作用？以上问题尚不清楚。　　 二、研究目的　　 本研究在此基础上以RhoC-FMNL2路径为主线，验证FMNL2参与结直肠癌Rho细胞运动信号通路，确定FMNL2在通路中的作用环节和关键作用蛋白，同时我们认为FMNL2也参与PRL3调控信号传导，通过探讨PRL3、RhoC、FMNL2三者关系可能涉及的相关信号通路，揭示FMNL2参与结直肠癌转移的新机制，为结直肠癌转移预测和靶向治疗提供理论基础。　　 三、实验方法　　 1.FMNL2、RhoC和PRL3在结直肠癌组织中的表达及相互作用关系　　 1.1结直肠癌石蜡标本及组织芯片制作　　 标本收集:70例结直肠癌标本选自南方医科大学珠江医院病理科档案石蜡组织块，具有完整的临床资料，本研究结直肠癌组织70例（包括发生淋巴结转移的31例，无淋巴结转移39例;高中分化的62例，低分化的8例），淋巴结转移癌31例（取自手术切除标本所附的淋巴结），其中男41例，女29例，年龄在23-83岁之间，中位年龄53岁。组织芯片制作:取样前对蜡块的切片作镜下形态学观察选取有典型组织形态学特点的区域，并在蜡块确定取样部位，使用组织微阵列仪在每个蜡块穿取组织芯，每个组织蜡块取3个孔，点样直径约1mm，制成的组织芯片备用。实验分为转移组31例和非转移组39例，转移组取原发灶及转移性淋巴结癌组织;非转移组仅取原发灶癌组织。　　 1.2免疫组织化学检测　　 组织芯片切片厚度5um，常规脱蜡脱水、抗原经高压锅热修复、封闭，常规HE染色，免疫组织（细胞）化学染色应用SP法，PRL3抗体、RhoC抗体(1∶100)、FMNL2抗体(1∶75)，操作步骤按试剂说明书进行，以PBS代替一抗作为阴性对照。　　 2 FMNL2沉默后结直肠癌细胞系中RhoC、PRL3表达变化　　 2.1细胞培养　　 结直肠癌细胞株SW620/FMNL2↓和SW620均为本实验室自存，SW620属于FMNL2高表达细胞株，来自结直肠癌的淋巴结转移病灶;SW620/FMNL2↓为前期实验基因沉默FMNL2表达的SW620细胞株。在37℃5％CO2条件下，培养于含5％胎牛牛血清的DMEM中，每周传代2～3次，取生长状态良好的细胞用于实验。　　 2.2免疫组化检测不同结直肠癌细胞中RhoC、PRL3表达变化　　 按照免疫组化试剂盒操作，首先制作细胞爬片，4％多聚甲醛固定20min，PRL3抗体、RhoC抗体（1∶100稀释）作为一抗，4°过夜孵育，苏木素复染，PBS液取代一抗作阴性对照。　　 2.3应用Westblot检测FMNL2沉默后结直肠癌细胞系中RhoC、PRL3蛋白表达变化。　　 收集结直肠癌细胞后提取蛋白，用12％SDS-PAGE电泳分离，转至PVDF膜，PVDF膜用5％脱脂奶粉进行封闭，加入兔抗人RhoC、PRL3（1∶150稀释）4℃孵育过夜，TBST洗膜5min×3次，加入二抗(1∶5000稀释)的HRP标记室温孵育1h，洗膜后经化学发光自显影成像，以β-actin为内参对照。　　 2.4 Real-time RT-PCR检测结直肠癌细胞中表达变化　　 提取总RNA1μg为模版，以oligo dT为引物，37℃反应15min，85℃5s，逆转录合成cDNA，以此cDNA链2μg为模板进行PCR扩增，通过相对定量荧光定量 PCR检测， RhoC引物序列上游5-ATGCGTGCAATCCGAAAGAAG-3;下游5-TCAGAGAATGGGACAGCCCCT-3，PRL3上游引物为5-AGGACGCCATCCAGTTCATC-3，下游引物为5-AGGTGAGCTGCTTGCTGTTA-3;以GAPDH为内参，PCR反应条件为:95℃30s;95℃，5s;60℃34s;40个循环后，应用ABI PRISM7500 Fast Real-TimePCR扩增仪检测各模板的Ct值，荧光信号检测。定量方法:以Folds=2-△△Ct表示实验组与对照组目的基因表达的倍比关系，实验组为SW620/FMNL2↓细胞株，对照组为SW620细胞株;公式如下:△△Ct=(Ct(targetgene)-Ct(GAPDH))实验组-(Ct(target gene)-Ct(GAPDH))对照组，实验重复3次。　　 3、统计学分析　　 应用SPSS13.0软件进行统计学分析，免疫组化结果在OLYMPUS双目显微镜高倍镜(×400)下观察，每例随机观察5个高倍镜视野，计算着色细胞比，判断结果:无着色细胞或阳性细胞≤5％为阴性（-/+），阳性细胞6％-30％为中度阳性(++)，阳性细胞31％-100％为强阳性(+++);结直肠癌细胞株使用Image-Pro Plus6.0病理图像分析软件计算出阳性细胞平均光密度（AOD值），实验结果用中位数(Median，M)表示;所有结果均以mean±SD表示，临床病理特征分组统计采用Mann-whitney U检验，数据比较采用单因素方差分析和非参数秩和检验，相关性分析采用Spearman等级相关检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。　　 四、结果　　 1、FMNL2、RhoC及PRL3在结直肠癌组织及淋巴结转移癌组织中的表达情况。　　 免疫组化结果显示，阳性表达均位于细胞质或细胞膜，呈棕黄色或棕褐色颗粒，在正常结直肠粘膜中呈阴性或弱阳性，在结直肠癌及淋巴结转移组织中出现中强阳性表达。PRL3、RhoC及FMNL2淋巴结转移灶中阳性表达率均明显高于结直肠癌组织（P＜0.01）。在不同类型结直肠癌组织中可见，三者在有淋巴结转移组中表达明显比未伴有淋巴结转移组增强，差异有具有显著性（P＜0.01)，但阳性表达与病人的年龄、性别、肿瘤细胞分化程度无相关性（P＞0.05）。通过比较三种蛋白在同一病例原发癌的表达，两两比较发现，RhoC与PRL3表达有相关性(r=0.355)，RhoC与FMNL2表达也存在有相关性(r=0.414)，差异均有统计学意义（P＜0.01）。　　 2、细胞免疫组化结果　　 PRL3、RhoC阳性表达呈棕黄色颗粒，均定位于细胞质。测量阳性细胞强弱用平均光密度(AOD)表示，RhoC蛋白在SW620细胞、SW620/FMNL2↓细胞中AOD值分别为0.2411±0.0157、0.1245±0.0128，差异有统计学意义(F=50.487，P＜0.05);而PRL-3蛋白的AOD值分别为0.2249±0.02543，0.1773±0.05608(P＞0.05)差异无统计学意义。　　 3、Westblot检测结果　　 以β-actin为内参对照，结果显示SW620/FMNL2↓细胞与β-actin灰度值比值为0.820±0.033，明显低于SW620细胞组1.214±0.060(P＜0.05)，FMNL-2表达沉默后，RhoC蛋白表达明显下降;PRL3蛋白表达在SW620细胞以及SW620/FMNL2↓细胞中与β-actin灰度值比值分别为0.835±0.061;0.686±0.018组间比较差异无统计学意义(P=0.082＞0.05)。　　 4、RT-PCR检测结果　　 Real-time PCR结果显示均有扩增，扩增曲线均进入平台期，溶解曲线未见杂峰，显示扩增为非特异性序列。通过公式计算发现，SW620细胞株为对照组，SW620/FMNL2↓细胞中RhoC mRNA的表达水平是SW620的0.618倍，差异有统计学意义(p＜0.05)，而PRL3 mRNA的表达水平未见明显差异。　　 五、结论　　 1、FMNL2、RhoC及PRL3可能都具有促进结直肠癌细胞远处转移的功能，可以作为反映结直肠癌转移的标志物。　　 2、FMNL2在Rho信号通路中起着重要作用，FMNL2沉默后RhoC的表达也下降，但是对PRL3作用不明显，间接提示PRL3可能是通过调节RhoC的上游因子，影响RhoC蛋白的表达促进肿瘤细胞远处转移。