【摘 要】
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非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的一种致死率高的急性、高度接触烈性传染病。ASF被世界动物卫生组织（OIE）列为法定报告疾病。1921年,ASF在肯尼亚被确认并在整个撒哈拉以南非洲地区传播。2018年8月,ASF首次在中国爆发并迅速席卷全国且持续流行,给养猪业造成巨大的经济损失,已成为我国
【基金项目】
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财政部和农业农村部:国家现代农业产业技术体系资助（CARS-35）； 河南省生猪产业技术体系（S-2012-06-02）； “中原英才计划”（育才系列）-中原青年拔尖人才（ZYYCYU202012148）； 河南省农业科学院优秀青年科技基金项目（2022YQ25）；
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非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的一种致死率高的急性、高度接触烈性传染病。ASF被世界动物卫生组织（OIE）列为法定报告疾病。1921年,ASF在肯尼亚被确认并在整个撒哈拉以南非洲地区传播。2018年8月,ASF首次在中国爆发并迅速席卷全国且持续流行,给养猪业造成巨大的经济损失,已成为我国养猪业最重要的传染病,且市场上仍没有有效的疫苗和抗病毒药物来预防和控制ASF,只能通过早发现早处理来控制疫情的扩散。随着疾病的流行,病毒毒力致弱,核酸检测已不能满足检测需求,因此,建立简单、快速、特异、适合大批量的临场抗体检测方法非常必要。ASFV是由五层独立结构组成的正二十面体形颗粒,基因组长170～194 kb,为双链闭合线性DNA分子,包含151～171个开放阅读框,结构复杂,目前几乎一半的ASFV基因功能尚不清楚。研究发现,由病毒基因B646L编码的主要衣壳蛋白p72,占病毒颗粒总量的1/3左右,且其氨基酸序列在不同的ASFV毒株中十分保守,p72三维结构表明天然状态下三个p72单体形成稳定的三聚体。p B602L是由ASFV基因B602L编码的一种非结构蛋白,能够辅助p72正确折叠形成三聚体,在ASFV正二十面体的组装过程中发挥重要作用。另外,此前的研究证实ASFV感染后的动物体内p72抗体产生的时间早、水平高,是建立抗体检测方法的理想靶标。p B602L是病毒的非结构蛋白,抗原表位保守且具有良好的免疫原性,感染后血清中抗体水平高,持续时间久,可作为病毒持续感染抗体检测的有效靶标。因此,本研究基于重组蛋白p72建立了胶体金免疫层析试纸,为有效防控ASF提供简便快速的监测、检测工具;基于重组蛋白p B602L建立了间接酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）抗体检测方法。可进行大规模样品的定量定性分析,未来ASF疫苗研制成功后,该方法也可用于区分野毒感染和疫苗免疫。具体内容如下:1.基于重组蛋白p72的胶体金免疫层析试纸的研制及应用本研究从NCBI获取ASFV基因序列（Gen Bank:MK333180.1）,将p72和p B602L基因序列进行密码子优化、合成,分别构建在p CMV载体上,即p CMV-p72和p CMV-p B602L。将p CMV-p72和p CMV-p B602L质粒共转染HEK293细胞,成功表达了p72蛋白,利用Flag抗体亲和层析纯化重组蛋白p72,使用凝胶过滤层析的方法进一步分离纯化p72三聚体蛋白。最终获得了折叠正确、高纯度的p72三聚体蛋白。采用胶体金标记p72三聚体蛋白,以葡萄球菌A蛋白（Staphylococcal protein A,SPA）作为检测线捕获蛋白,以抗p72蛋白多克隆抗体作为质控线,成功研制了检测灵敏性高（检测ASFV抗体阳性标准血清的最低检测极限可达1:204,800）、重复性好（试纸间变异系数CV均低于15%）、特异性良好的胶体金免疫层析试纸。在没有疫苗的情况下,抗体存在是病毒感染的重要指征,因此该试纸可用于ASFV感染的监测。2.基于重组蛋白pB602L建立的间接ELISA抗体检测方法的研制将重组质粒pCMV-B602L转染至HEK293F细胞中获得高生物活性和高表达量的重组蛋白p B602L,采用Ni亲和层析和凝胶过滤层析两步法制备高纯度目的蛋白。ELISA检测方法因其易于定性定量检测、便于标准化且具有较高的灵敏度,非常适合于猪群健康情况的动态监测和大规模的样本流行病学调查。基于重组蛋白p B602L建立的检测方法与商品化ELISA检测试剂盒相比,有较高的灵敏性且符合率可达93.75%;批间和批内的重复性良好;变异系数（CV）均低于10%,有良好的稳定性。适用于对ASF的血清学监测。综上,本研究利用真核表达系统哺乳动物细胞HEK293成功表达制备了重组蛋白p72三聚体和p B602L,为进一步开展ASFV p B602L和p72蛋白的功能研究提供了丰富的实验材料。另外,基于p72三聚体研制出了ASFV抗体检测胶体金免疫层析试纸并进行中试生产,在猪场开展了临床实验应用。基于病毒的非结构蛋白p B602L成功建立了间接ELISA检测方法并进行评估。本研究建立的两种抗体检测方法,为ASFV猪场现场快速检测提供了有效的工具,为ASF防控工作、流行病学调查提供了重要的技术支撑。
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