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目的：参环毛蚓的药材习称为“广地龙”,是国内外药材市场中公认的地龙优质产品。然而广地龙重金属超标问题一直制约其进一步发展。本团队通过实验研究,发现药材重金属超标与其动物所具有的重金属富集和耐受生理特性有直接关系,并且已确认重金属富集作用与金属硫蛋白(MTs)相关。但是,更深层次地解释参环毛蚓重金属富集现象如何产生?其调控机制如何?在不影响已有药效的前题下,如何从源头上控制药材重金属超标等问题一直未能解决。本文试图从MTs入手,系统阐明MTs在调控参环毛蚓重金属富集中的作用,明确其重金属调控机理,同时通过动物实验考察MTs对哮喘小鼠气道炎症和气道高反应的影响,为揭示参环毛蚓重金属富集特性的分子生物学机制奠定基础,也为进一步制定解除广地龙药材重金属富集策略,保证其药材安全有效提供依据。方法：1.采用划线法活化含有pET-32a(+)-MT-2重组质粒及pET-32a(+)对照质粒保存菌株,IPTG诱导其表达,使用SDS-PAGE和Western Blot检测及确认其表达情况。2.不同浓度重金属镉胁迫处理表达重组MT-2基因菌株,分别采用平板涂布观察法及原子吸收法考察其提高重金属耐受及富集特性。3.将MT-2重组转化菌经IPTG诱导表达后,离心获得菌体,再经超声和溶菌酶破菌后SDS-PAGE分析其表达形式,并利用Ni柱纯化试剂盒对目的蛋白进行纯化,同时体外建立自由基损伤DNA模型,通过琼脂糖电泳考察纯化MT-2重组蛋白抗氧化损伤的能力。4.结合GenBank数据库中有关蚯蚓Actin序列,设计引物,通过PCR扩增,扩增产物交由华大基因生物公司测序,Blast相似性搜索验证扩增和测序结果的准确性。根据获知内参Actin基因及MT-2 cDNA序列设计引物,通过荧光定量PCR研究不同浓度重金属胁迫处理下参环毛蚓体内MT-2 mRNA转录水平的变化。5.根据已知的MT-2 cDNA序列,设计特异引物,通过PCR扩增MT-2基因的编码区序列,扩增产物经测序后自行比对分析。基于该序列设计3条特异引物,采用基因步移技术克隆其上游的启动子序列,同时运用Promoter Prediction在线软件分析预测其顺式元件。6.采用BALB/c哮喘小鼠模型,使用全身体积扫描系统进行气道反应性测定,取其肺部组织病理组织切片进行HE、PAS染色,用台盼蓝染色法对其细胞灌洗液(BALF)中总细胞数计数,同时使用ELISA分别检测小鼠血清中的IgE以及BALF中IL4、IL5、IL13的水平。结果：1. SDS-PAGE电泳表明重组MT-2蛋白成功表达,Western blot证实了表达产物的正确性,表明MT-2重组菌株可用于后续实验。2.重金属耐受性实验表明,表达MT-2重组蛋白的菌株耐镉的能力明显高于空白对照菌,且镉的最高耐受剂量可达250 μ M。重金属富集实验表明,较空白对照菌,表达MT-2重组蛋白的菌株重金属富集能力显著增强。在低剂量组镉离子(10μM和20pM)处理下,MT-2重组菌吸附重金属的含量分别为对照菌的1.9和8.8倍；而在高剂量组镉离子(250μM和500μM)处理下,MT-2重组菌吸附重金属的含量分别为对照菌的4.4和8.3倍。结果表明,金属硫蛋白在抗重金属毒害、重金属富集方面具有重要作用。3. SDS-PAGE分析,MT-2重组蛋白的表达形式有可溶和不可溶两种形式,主要以可溶形式为主。将收集菌体裂解上清液经Ni纯化试剂盒可获得纯度较高的MT-2重组蛋白。体外琼脂糖凝胶电泳显示,MT-2重组蛋白可明显保护自由基引起的DNA损伤,且与其剂量呈正相关。4.经PCR扩增、测序后获得参环毛蚓Actin部分cDNA序列,再经Blast相似性搜索,结果表明Actin基因片段的扩增和测序结果准确和可靠性,可用于参环毛蚓定量PCR的研究。MT-2基因实时定量PCR结果表明,重金属镉可显著诱导MT-2 mRNA的表达,表达水平呈一定的剂量-效应关系。镉诱导3天时,mRNA的表达已显著升高,经镉诱导7天时,其表达水平达到最高。5.经PCR扩增、测序后获得2826 bpMT-2基因编码区序列,将该序列与已知的MT-2cDNA序列(登录号为KC787373.1)进行比对,发现MT-2编码区由4个外显子和4个内含子组成。基因步移技术克隆得到1534bp的启动子序列,经Promoter Prediction在线软件分析,结果显示该序列不仅含有TATA-box、CAAT-box等核心启动子软件,还具有3个参与调控MT-2表达的特异响应重金属MRE元件。6.对小鼠气道阻力值的测定发现,生理盐水和不同浓度的乙酰甲胆碱激发后,哮喘模型组小鼠气道阻力显著高于空白组(p<0.01),而MTs组与模型组比无明显变化,不具有统计学意义(p<0.05)；模型组小鼠BALF中总细胞高于空白组(p<0.01),MTs组与模型组比总细胞数无明显下降,无统计学意义；模型组血清IgE和BALF中IL4、IL5及IL13的水平明显高于空白组(p<0.01),MTs与模型组比,无统计学意义。结论：本研究从蛋白、基因以及整体水平等多个层面,明确了MTs介导参环毛蚓重金属富集作用机制以及其调控机理,同时还明确了MTs是使机体免受重金属毒害的应激产物,且对广地龙平喘功效几无贡献。研究结果表明MTs可作为进一步解除或阻断其重金属离子富集的重要靶点,既为今后利用基因工程技术保障药用部位的品质夯实了基础,又为培育参环毛蚓优良新品种,从源头上保证临床用药安全有效开辟了新途径。