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沙门菌是公认的世界上最常见的微生物病原体之一,该细菌编码成簇的规律间隔短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences,CRISPR）和CRISPR相关基因（CRISPR-associated genes,cas genes）组成的CRISPR-Cas系统,为抵御外来核酸入侵提供了适应性免疫。之前的研究表明,细菌可以利用自身编码的CRISPR-Cas系统靶向降解内源性基因,从而改变细菌自身毒力相关特征及其对宿主的毒力作用。然而,沙门菌中的CRISPR-Cas系统在细菌入侵宿主细胞过程中是否具有相似的功能尚不清楚。本研究通过检测沙门菌关键毒力基因的表达量,筛选出可能具有不同致病性的沙门菌进行毒力表型的检测,从而筛选出携带CRISPR-Cas系统的高致病性沙门菌进行后续研究。分析cas3基因缺失导致的毒力表型变化,并在转录组内筛选cas3相关基因。全面了解细菌CRISPR-Cas系统的核心基因cas3与毒力的相关性及其调控机制,为沙门菌感染宿主及其他细菌毒力表型的调控提供深入的认识,为沙门菌病的防治提供理论依据。通过PCR检测150株鸡沙门菌中CRISPR1和CRISPR2位点,并统计其检出情况。发现CRISPR1位点的检出率为78%,CRISPR2的检出率为80.67%,携带CRISPR位点的菌株占总数的比例为92.67%,仅有11株鸡沙门菌不携带该位点,可见CRISPR-Cas系统携带菌株为流行沙门菌,这可能是沙门菌长期进化选择的结果。以标准菌鼠伤寒沙门菌CVCC541为对照,通过q RT-PCR检测各菌株中23个关键毒力基因的相对表达量,包括:stn、spv R、spv B、spv C、prg H、hil A、avr A、ttr C、ssa Q、mgt C、sop B、rpo S、bcf C、mis L、fim A、flj B、lpf C、sod C1、rck、pef A、tra T、sop E1和pag C。结果发现鼠伤寒、肠炎和鸭沙门菌的毒力基因表达水平相对较高。建立RAW264.7细胞和IPEC-J2细胞感染模型,检测沙门菌对两种宿主细胞感染3 h时的粘附侵袭力。根据细菌血清型及细胞感染试验的测定结果,筛选出9株携带CRISPR位点的鸡沙门菌进行雏鸡感染试验,检测其对动物的致病性,从而筛选出携带CRISPR-Cas系统的高致病性沙门菌。这些细菌包括:对两种细胞的粘附侵袭力均较强的菌株211、172、64、92、94、76,中等粘附侵袭力菌株201、62及1株对巨噬细胞具有较强的粘附侵袭力但对肠上皮细胞无粘附侵袭力的206号菌株。其中肠炎沙门菌2株,鼠伤寒沙门菌4株,鸭沙门菌2株及印第安纳沙门菌1株。肌肉注射感染雏鸡后,鼠伤寒沙门菌172号菌株致死率为33.33%,其余菌株均为100%。经口感染及二次感染雏鸡后,9株沙门菌经两次感染雏鸡的致死率变异性较大,分别在0-16.67%之间和0-100%之间。其中201号菌株致死性最强,经口感染和二次感染的致死率分别是16.67%和100%,其次211号菌株两次感染的致死率分别是0和80%,考虑到211号菌株的细胞粘附侵袭力较强,因此我们选择211号菌株（以下统称cas3 WT）进行后续cas3基因相关功能和基因表达调控的研究。利用自杀质粒p LP12,通过两次同源重组构建肠炎沙门菌211的cas3基因缺失突变株Δcas3;利用无缝克隆构建cas3基因的p BAD33-CM重组表达质粒,将该质粒转入Δcas3得到cas3基因回补表达株Δcas3/p BAD33-CM-cas3（以下统称Δcas3/p-cas3）。通过测定cas3 WT,Δcas3和Δcas3/p-cas3的生长力、生物被膜形成情况、对细胞的粘附侵袭力,细胞致死率,动物致死性的差异,考察cas3基因对细菌毒力表型的影响。结果显示三株菌的生长曲线无显著差异,可以进行其他毒力表型的差异分析。后续研究发现,cas3基因的缺失突变导致沙门菌的其他毒力显著降低,如生物被膜形成能力显著降低,感染与侵入宿主细胞的细菌量显著降低,感染导致宿主细胞死亡比例显著降低。另外通过三株菌的雏鸡感染试验,计算得出三株菌的半数致死量(median lethal dose,LD50),结果显示Δcas3的半数致死量极显著高于cas3 WT和Δcas3/p-cas3,即cas3基因的缺失导致沙门菌致病力显著减弱。以上结果说明cas3基因对沙门菌的毒力具有一定的影响。采用第二代测序（Next-Generation sequencing,NGS）技术,基于Illumination Hi Seq测序平台,对构建的文库进行双末端（Paired-end,PE）测序,筛选由于cas3基因敲除而差异表达的毒力基因,从而分析cas3基因与这些毒力基因的关系。RNA-Seq结果显示,以cas3 WT菌株为对照,Δcas3菌株中有141个差异基因,其中81个基因表达量显著下调,60个基因表达量显著上调。这些差异基因中,沙门菌感染及入侵宿主细胞的信号通路中毒力岛1（Salmonella pathogenicity island 1,SPI-1）编码的III型分泌系统（type III secretion system,T3SS）相关基因sip A、sip C、sip D、spt P、sop E、sop E2等均下调表达,群体感应相关基因lsr B、lsr G、lsr E和lsr F均上调表达,鞭毛及生物被膜相关基因saf A、saf B、saf C、saf D和bdm表达量也发生显著变化。综合分析得出,cas3可能通过调控群体感应、SPI-1-T3SS、鞭毛等基因的表达水平使得沙门菌毒力增强。总之,本论文首先结合细菌血清型、毒力基因的表达、细胞感染试验及动物致病性鉴定,筛选携带CRISPR-Cas系统的高致病性鸡源沙门菌,然后通过构建其I-E型CRISPR-Cas系统核心基因cas3的缺失突变株和回补表达株,初步研究鸡源沙门菌中CRISPR-Cas系统在毒力调控中的功能及其作用机制。沙门菌中CRISPR-Cas系统可能利用其核心蛋白Cas3调控毒力及毒力相关基因的表达,进而调控细菌的生物被膜形成能力、细胞粘附侵袭力、宿主细胞致死性及动物致病性等毒力特征。为沙门菌毒力机制的研究提供新的方向,对临床沙门菌病的防治具有重要的实际意义。