论文部分内容阅读
目的: 观察隔药饼灸天枢穴（双）、气海穴对克罗恩大鼠靶器官结肠、中枢脊髓背角和下丘脑中SP/NK1R、VIP/VIPR1调节作用，从该角度阐释隔药饼灸治疗克罗恩病的机制。 方法: 参照国际公认的Morris方法，应用三硝基苯磺酸(TNBS)制备大鼠克罗恩病模型。采用随机设计方法分成隔药灸组、美沙拉嗪组、模型组和正常对照组，每组8只。正常组(N=8):不作任何治疗，仅作与隔药灸组相同的抓取与固定。模型组(N=8):不作任何治疗，仅作与隔药灸组相同的抓取与固定。隔药灸组(N=8):取穴天枢（双）、气海;药饼配方:附子、肉桂、丹参、黄连等药研末后加适量黄酒调和，用模具制成直径1、厚0.5cm大小，上置约90mg小艾炷施灸，每次每穴各灸2壮，每日1次，连续治疗10天。美沙拉嗪组(N=8):采用美沙拉嗪溶液灌胃。每日投药量按成人（70kg体重）与大鼠（200g体重）1∶0.018比例（据《药理学实验方法》）配制美沙拉嗪溶液，每日2次，共灌胃10天。治疗结束后，测定大鼠结肠大体损伤评分，HE染色光镜及电镜下观察结肠组织病理学改变;采用免疫组织化学技术，检测大鼠结肠黏膜SP、NK1R、VIP、VIPR1的表达;采用酶联免疫吸附测定(ELISA)技术，检测大鼠脊髓背角和下丘脑中SP、NK1R、VIP、VIPR1含量;采用Real-time PCR技术检测结肠黏膜、脊髓背角和下丘脑中NK1R和VIPR1 mRNA的表达情况。 结果: 通过对大鼠一般情况观察可见，模型制备后模型组大鼠进食减少，活动少，精神状态欠佳，大便质软或不成形，毛色暗黄枯槁;隔药灸和美沙拉嗪组经干预治疗后，大鼠一般情况均有不同程度改善。 结肠大体损伤评分分析:模型组与正常组比较，大鼠结肠外观色暗质地偏硬，后腹壁粘连程度明显，肠道内部可见，肠壁增厚，黏膜充血明显欠光滑，可见多个散在溃疡分布，大体损伤评分均显著高于正常组(P＜0.01);与模型组相比，隔药灸组和美沙拉嗪组大鼠结肠质软色淡红，黏膜面光滑平整，肠壁增厚程度改善，与周围组织无明显粘连，少量散在分布小溃疡，隔药灸组、美沙拉嗪组结肠大体损伤评分明显低于模型组（P＜0.05），且隔药灸组大鼠大体损伤评分显著低于美沙拉嗪组(P＜0.01)。 HE病理染色:通过HE染色对结肠病理损伤进行观察:与正常组比较，模型组大鼠结肠黏膜层有明显裂隙状溃疡形成，深达黏膜下层，固有层间质、黏膜下层结缔组织明显水肿伴大量淋巴细胞浸润，黏膜下层可见结节病样肉芽肿形成;与模型组比较，隔药灸组和美沙拉嗪组大鼠结肠组织结构不同程度恢复，结肠黏膜腺体排列较整齐，黏膜层有少量炎性细胞浸润，黏膜下层有轻度水肿、增厚及炎性细胞、成纤维细胞浸润。 电镜观察:正常组大鼠结肠肠黏膜表面微绒毛排列整齐，未见微绒毛脱落，细胞核染色质有凝集现象，细胞连接较紧密，线粒体较丰富。模型组细胞连接尚可，部分线粒体嵴破坏，胞浆内有空泡，核染色质凝集，肠黏膜表面微绒毛部分区域缺失。隔药饼灸组肠黏膜表面微绒毛排列较紧密，少量微绒毛缺失和脱落，核染色质凝集，线粒体丰富，细胞连接紧密，胞浆内有少量小空泡。美沙拉嗪组细胞连接尚可，少量线粒体嵴破坏，肠黏膜表面微绒毛排列欠紧密，部分区域微绒毛脱落，细胞器结构较少，胞浆内有空洞。 结肠组织SP、NKIR、VIP、VIPR1蛋白和NK1R、VIPR1 mRNA表达及隔药灸的调节作用: 免疫组织化学方法检测结果显示，与正常组比较，模型组SP、NKIR、VIP、VIPR1的表达显著增高(P＜0.01)，隔药灸组和美沙拉嗪组SP、NKIR、VIP、VIPR1的表达也有明显差异(P＜0.05);与模型组比较，隔药灸组和美沙拉嗪组SP、NKIR、VIP、VIPR1蛋白表达均显著降低(P＜0.01，P＜0.05)，而隔药灸组和美沙拉嗪组两组间无明显差异（P＞0.05）。 Real-time PCR结果显示，与正常组比较，模型组NK1R mRNA的蛋白表达显著增高(P＜0.01)，隔药灸组和美沙拉嗪组NK1R和VIPR1 mRNA的蛋白表达也有明显差异(P＜0.05，P＜0.01);与模型组比较，隔药灸组和美沙拉嗪组NK1R和VIPR1 mRNA的蛋白表达均显著降低（P＜0.01），而隔药灸组和美沙拉嗪组两组间NK1R和VIPR1 mRNA的蛋白表达无明显差异(P＞0.05)。 脊髓背角SP、NKIR、VIP、VIPR1蛋白和NK1R、VIPR1 mRNA表达及隔药灸的调节作用: ELISA检测结果显示，与正常组比较，模型组SP、NK1R、VIP、VIPR1的含量表达显著增高(P＜0.01)，隔药灸组和美沙拉嗪组SP、NK1R、VIP、VIPR1的含量表达也有明显差异(P＜0.05，P＜0.01);与模型组比较，隔药灸组和美沙拉嗪组SP、NK1R、VIP、VIPR1的含量表达均显著降低(P＜0.01)，而隔药灸组和美沙拉嗪组两组间SP的含量表达，有明显差异(P＜0.05)，而NK1R、VIP、VIPR1的蛋白表达无明显差异(P＞0.05)。 Real-time PCR结果显示，与正常组比较，模型组NK1R、VIPR1 mRNA的蛋白表达显著增高(P＜0.01)，隔药灸组和美沙拉嗪组NK1R、VIPR1 mRNA的蛋白表达也有明显差异(P＜0.05);与模型组比较，隔药灸组和美沙拉嗪组NK1R、VIPR1mRNA的蛋白表达均显著降低(P＜0.01)，而隔药灸组和美沙拉嗪组两组间NK1R、VIPR1 mRNA的蛋白表达无明显差异（P＞0.05）。 下丘脑SP、NKIR、VIP、VIPR1蛋白和NK1R、VIPR1 mRNA表达及隔药灸的调节作用: ELISA检测结果显示，与正常组比较，模型组SP、NK1R、VIP、VIPR1的含量表达显著增高(P＜0.01)，隔药灸组和美沙拉嗪组SP、NK1R、VIP、VIPR1的含量表达也有明显差异(P＜0.01);与模型组比较，隔药灸组和美沙拉嗪组SP、NK1R、VIP、VIPR1的含量表达均显著降低(P＜0.01)，而隔药灸组和美沙拉嗪组两组间相比，SP、VIP、VIPR1的蛋白表达无明显差异(P＞0.05)。NK1R的含量表达有明显差异(P＜0.05)。 Real-time PCR:与正常组比较，模型组NK1R、VIPR1 mRNA的蛋白表达显著增高（P＜0.01），隔药灸组和美沙拉嗪组NK1R、VIPR1 mRNA的蛋白表达也有明显差异(P＜0.05);与模型组比较，隔药灸组和美沙拉嗪组NK1R、VIPR1 mRNA的蛋白表达均显著降低(P＜0.01)，而隔药灸组和美沙拉嗪组两组间NK1R、VIPR1mRNA的蛋白表达无明显差异(P＞0.05)。 结论: 1.隔药灸天枢、气海穴能够缓解克罗恩病大鼠结肠炎症，促进结肠组织病理损伤的修复。 2.隔药灸能够降低克罗恩病大鼠靶器官结肠组织SP/NK1R mRNA、VIP/VIPR1mRNA的表达，发挥炎症抑制作用，可能是隔药灸治疗克罗恩病的重要机制之一。 3.隔药灸能够降低克罗恩病大鼠中枢脊髓背角和下丘脑组织中SP/NK1RmRNA、VIP/VIPR1 mRNA的表达，从中枢水平调节，可能是隔药灸治疗克罗恩病的重要机制之一。