β-淀粉样蛋白对癫痫发作影响的研究。β-淀粉样蛋白(p-amyloid protein，Aβ)是Alzheimer Disease(AD)脑内特征性病理改变一老年斑(senile plaques，SP)的主要成分[1]。Aβ具有对神经系统广泛的生物学效应。高浓度的，或聚集状态Aβ被认为具有神经毒性作用。癫痫是一种常见的脑部疾病，其特征为脑神经元过度放电所致的反复痫样发作。一些临床资料显示颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy，TLE)病人的脑内可以检测到明显的SP，提示TLE对SP的形成有重要影响。SP的形成和癫痫发作之间的关系目前还不明了，作为SP的主要成分-Aβ可能参与加重或减轻癫痫的发作。本实验对Aβ对癫痫发作的可能影响进行了初步研究。主要研究结果如下： 1.动物癫痫模型采用Wistar大鼠海人藻酸(Kalnic Acid，KA)(1μg/μ1，1μ1)侧脑室注射。用免疫组织化学染色，免疫荧光化学方法观察癫痫病人癫痫灶组织内Aβ以及癫痫动物脑内β淀粉样蛋白前体(Amyloid precursor protein，APP)、Aβ的分布情况。结果显示：癫痫病人癫痫硬化灶内有Aβ的点状分布。Wistar大鼠KA致痫6小时后，免疫组织化学染色海马、皮层Aβx-40免疫阳性物质明显较正常组增多；免疫荧光检测Aβx-42，同样见致痫大鼠脑内海马阳性物质增加。另外，分别用APP-N抗体和APP-C抗体检测显示KA致痫大鼠脑内APP有增加，以海马和皮层增加明显。 2.从mRNA水平观察KA致痫大鼠脑内APP基因表达情况，以及其它神经元退行性相关蛋白-tau蛋白的基因表达，并探索可能参与APP、tau基因剪接有关机制。用RT-PCR方法检测的结果显示：KA致痫6h后，海马内APPmRNA表达增加，易产生Aβ的APP异型体APP751和APP770的比例增加。对tau mRNA的5和3端检测显示tau表达在致痫6h后也明显增加，并且有5’端发生剪辑的改变。另外剪接因子tra2β，NSSRl在KA致痫的诱导下也有明显增加。以上结果提示：癫痫发作可以促进脑内APP表达，同时癫痫可影响中枢mRNA剪辑机制，导致易产生Aβ的APP异型体增加，促进Ap产生增加。 3.为了观察Aβ对癫痫发作的影响，用侧脑室注射不同剂量的可溶性单体Aβ1-40(0.004nmo1，0.04nmo1，0.4nmo1)干预KA诱发的癫痫。通过对大鼠癫痫发作行为学观察，发现预先给予可溶的单体Aβ1-40，大鼠癫痫发作潜伏期延长，发作强度也有一定程度减弱，以0.04nmo1剂量较为明显。 4.观察了大鼠侧脑室注射不同剂量可溶的单体Aβ1-40对KA致痫大鼠大脑皮层脑电的影响。大鼠脑内注射KA后30～40min即在皮层记录到痫样放电，表现为典型的单个棘波、尖波和棘慢波，以及短暂的，爆发性的多棘慢波或不规则棘慢波。而给与Aβ1-40后，这种棘慢波明显减少，平均脑电总功率也降低，抑制效果以0.04nmo1的Aβ1-40较为明显。通过脑电记录进一步说明可溶性Aβ1-40单体对KA诱导癫痫发作有一定的抑制作用。 5.在体外，新生6天SD大鼠海马脑片上用picrotoxin(20μM)诱导痫样放电。细胞外场点位记录显示，灌流10min左右即可记录到持续的痫样放电，置换灌流液，用含2nmo1 Aβ1-40的picrotoxin人工脑脊液灌流，2min后痫样放电明显被抑制，再用含picrotoxin人工脑脊液冲洗，再次出现痫样放电。说明在体外Aβ也能抑制海马脑片痫样放电。 6.观察Aβ1-40对KA致痫引起神经元损伤的影响，外源性地给与不同剂量的可溶的单体Aβ1-40(0.004nmo1，0.04nmo1，0.4nmo1)侧脑室注射，再同侧侧脑室注射KA(1ug)。焦油紫(cresyl violet，CV)染色和Fluoro-JadeB染色均提示Aβ1-40可减少海马神经元损伤。结果提示，外源性给予的一定剂量的可溶性单体Aβ1-40可抑制KA诱导的兴奋性毒性对神经元的损害。 7.为进一步观察内源性的Aβ对癫痫发作是否有影响，我们给予大鼠侧脑室注射γ分泌酶抑制剂(13.5μM，2μ1)，抑制APP水解产生Aβ，再同侧侧脑室注射致痫剂量的KA。行为学观察结果和单纯KA致痫组没有显著差别，但CV染色和Fluoro-Jade B染色显示海马神经元损害较单纯KA组严重，从而进一步提示内源性的Aβ也有一定抑制KA诱导的癫痫发作及其导致的神经元损害的作用。 8.由于各种致痫刺激可促进c-fos迅速表达，根据FOS蛋白在致痫刺激后的表达程度的高低可判断药物或其它相关因素在治疗或致痫作用中的大小。我们采用免疫组化的方法观察了给予不同处理后的大鼠脑内FOS蛋白的分布情况。结果显示，在单纯KA致痫组脑内海马、梨状皮层、杏仁核这些与癫痫发作密切相关的部位的FOS蛋白均较正常对照组显著增加。KA诱导致痫前预先侧脑室注射γ分泌酶抑制剂抑制(13.5μM，2μ1)Aβ的产生，导致动物的梨状皮层、杏仁核部位较单纯KA组明显增加；预先给予0.04nmo1的可溶性Aβ可抑制各脑区KA诱导的FOS蛋白表达的增加。提示适当剂量的可溶的Aβ可抑制KA的兴奋毒性作用。 9.为观察纤维状或高剂量的Aβ对KA诱导癫痫的脑损害，预先给Wistar大鼠侧脑室内注射高剂量的Aβ(0.4μmo1)或海马内注射纤维状Aβ(0.4μmo1)，再同侧侧脑室注射KA(0.4μ1，1μg/μ1)。CV染色和Fluoro-JadeB染色显示纤维状Aβ和高剂量的Aβ均加重了KA诱导的海马神经元的损害。这可能提示为什么AD病人是老年癫痫的高危人群[3]。 10.初步探讨可溶性单体Aβ对癫痫抑制作用的可能机制。用免疫组织化学方法观察到癫痫发作6h时，Munc-18蛋白水平表达下降，而预先给予Aβ再诱发癫痫组Munc-18蛋白表达较正常组变化不明显，由于Munc-18对递质释放有负性调节作用，说明AD可能通过影响Munc-18的表达调节神经递质的释放。 综上所述，癫痫病人以及海人藻酸(KA)诱导致痫大鼠脑内有Aβ的增加，Aβ的增加与KA致痫导致的APP表达上调有关。一定剂量的可溶性单体Aβ1-40可抑制动物KA诱导的癫痫的发作以及兴奋性毒性作用。可溶性Aβ单体对癫痫抑制作用可能与Munc-18有关。