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为了探讨稀土氯化铈、<’60>Coγ射线、氯化铈与γ射线联合作用对细胞凋亡的影响以及作用机制,本实验以K562肿瘤细胞作为研究对象,采用Annexin-V凋亡试剂盒、流式细胞仪检测细胞凋亡,以及荧光显微镜下进行形态学观察等方法,研究了稀土氯化铈、<’60>Coγ射线、氯化铈与γ射线联合对K562细胞凋亡的影响;并结合细胞周期及细胞凋亡相关蛋白p53、Bax和Bcl-2的研究,探讨氯化铈、<’60>Coγ射线、氯化铈与γ射线联合作用K562细胞后的凋亡机制。细胞周期采用流式细胞仪检测,p53、Bax、Bcl-2采用免疫印迹法检测。
氯化铈对K562细胞凋亡的影响的实验研究共设了0、0.5、1、3、15、30、90、150、250、500mg/L 10个浓度,分别在氯化铈加入细胞培养体系后24、48和72h检测细胞凋亡率。实验结果显示:浓度为3mg/L的氯化铈加入后24h及500mg/L加入后48h的细胞凋亡率显著升高,与阴性对照组比较有统计学意义(方差分析P<0.05),而在72h检测时各浓度组与阴性对照组相比均无统计学差异。
不同剂量<’60>Coγ射线对K562细胞凋亡的影响的实验研究设了8个照射剂量(剂量率为1Gy/min)即:0、0.5、1、3、7、10、15、20Gy,分别在照射后24、48、72h进行细胞凋亡率的检测。结果可见:48h时3、7Gy组和72h时3、7、10、15、20Gy组可以显著诱导K562细胞凋亡,并且随着照射剂量的增加和作用时间的延长,凋亡率呈上升趋势。
在氯化铈和<’60>Coγ射线联合作用对K562细胞凋亡的影响的实验研究中,氯化铈浓度选择3mg/L和1 5mg/L、γ射线照射剂量为2Gy,加氯化铈的时间分别在照射之前2h和24h,于照射后24h和48h检测细胞凋亡率。结果表明:在照前24h加3mg/L和15mg/L氯化铈,于照后24h和48h检测,3mg/L浓度组在这两个时间点的凋亡率与对照组相比均具有统计学意义的显著增高,而15mg/L组只在48h的差异显著;在照前2h加3mg/L和15mg/L氯化铈的细胞凋亡检测结果显示,3mg/L在照后48h、15mg几在照后24h和48h检测的细胞凋亡率均明显增高,与对照组之间的统计学差异显著(方差分析,P<0.05)。统计结果还表明:不同时间加入的氯化铈和射线之间有交互作用,且有统计学意义。
凋亡机制研究和细胞周期测定结果表明:在照射剂量为2Gy、氯化铈浓度为3mg/L、照射前24h加氯化铈,照射后24h进行检测的结果为:氯化铈组、γ射线组、氯化铈与γ射线联合作用组的Bax蛋白含量比阴性对照组明显增高,Bcl-2和p53的变化不明显。细胞周期测定结果表明:γ射线组、氯化铈与γ射线联合组均出现显著的G2/M期阻滞和S期细胞比例下降,与对照组相比有统计学意义(P<0.01);而氯化铈组则只出现S期细胞比例明显下降(P<0.05)。
通过本研究得出以下结论:
1.氯化铈和γ射线单独作用均可诱导K562肿瘤细胞凋亡,其诱导作用与氯化铈和γ射线的剂量和作用时问有关;
2.在适宜条件下,氯化铈和射线联合可显著诱导K562细胞凋亡;
3.<60>Coγ射线、氯化铈与γ射线联合都显著引起细胞周期在G2/M期阻滞和S期细胞比例减少,氯化铈单独作用只引起S期细胞比例明显的减少;
4.氯化铈、<60>Coγ射线、氯化铈与γ射线联合作用,对K562肿瘤细胞凋亡的影响机制可能是通过Bc1-2(抑凋亡蛋白)/Bax(促凋亡蛋白)的降低,并且不依赖p53的线粒体凋亡途径。