背景肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,KP)是引起社区感染和医院内感染的重要病原菌。随着人们对抗生素的越发依赖及大量使用,耐药KP愈发常见,成为临床感染控制方面一个十分棘手的难题。成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及其相关基因(CRISPR associated sequences,Cas)组成的CRISPR/Cas系统,是广泛存在于细菌和古细菌中的获得性新型微生物防御系统,能应对质粒的接合或转化以及噬菌体感染引起的基因导入,限制耐药或毒力等基因的水平转移(HGT)。目前关于CRISPR的研究多集中在大肠杆菌、志贺菌,而KP方面的研究甚少涉及。目的1.通过分析KP中CRISPR分布与菌株耐药表型和耐药基因的关系,探讨菌株中CRISPR的分布对菌株耐药表型和耐药基因的影响。2.通过分析Spacer同源质粒或噬菌体与Spacer所在菌株耐药信息之间的联系,探讨KP中CRISPR对菌株耐药性的调控机制。3.探究KP分离地点与其CRISPR分布和耐药表型之间的关系。方法1.应用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增KP的CRISPR位点和耐药基因并进行测序分析,采用改良Kirby-Bauer(K-B)法检测菌株耐药表型,并用SPSS19.0分析CRISPR位点与耐药表型和耐药基因之间的相关性。2.用CRISPRTarget查找Spacer同源质粒或噬菌体并在NCBI中下载其基因组,上传至Center for Genomic Epidemiology网站获取同源质粒或噬菌体的耐药基因信息。结合PCR检测到的菌株所携带的耐药基因,分析两者之间的耐药基因携带情况是否有交叉。3.收集菌株分离地点信息,同时用ClustalX 2.1对菌株的间隔序列进行一致性分析。结合菌株分离地点信息、一致性分析结果和耐药表型,分析菌株分离地点与CRISPR分布特征和耐药表型的关系。结果1.CRISPR阳性菌株耐药基因的阳性率小于CRISPR阴性菌株(除耐药基因VIM、IMP和qurA外),并且是否携带CRISPR与耐药基因blaOXA、TEM、tetA、tetB、sul2分布之间的差异有统计学意义(P<0.05);携带有CRISPR的菌株对单种抗菌药物的耐药率均小于不携带有CRISPR的菌株(除NOR和AMP外),且菌株对C、TE和SXT三种抗菌药物的耐药性与是否携带CRISPR位点之间的分布差异有统计学意义(P<0.05);抗菌药物C、TE、和SXT,其对应敏感株的CRISPR1/CRISPR2中含有多间隔序列的比例大于耐药株CRISPR1/CRISPR2中含有多间隔的比例,且CRISPR1和CRISPR2的间隔序列数目与单种抗菌药物C、TE、和SXT的耐药性之间的分布差异有统计学意义(P<0.05)。2.菌株携带的耐药基因在其Spacer同源质粒或噬菌体上检测到的耐药基因中均可找到,并且菌株的耐药表型与其携带的耐药基因高度符合。3.分离于新乡医学院第一附属医院的菌株,其CRISPR分布完全相同,耐药表型接近完全相同;新乡市中心医院医院分离菌株的耐药表型完全相同。不同分离地点菌株的Spacer之间有交叉,可能包含了菌株的过往生存环境信息。结论1.KP中的CRISPR在一定程度上可以阻止耐药基因的传递,同时KP菌株中CRISPR的存在在很大程度上降低了菌株对抗菌药物的耐药性;CRISPR调控菌株耐药性的关键可能在于间隔序列。2.KP通过将外来质粒的耐药基因片段整合到菌株的基因组中并表达来实现对菌株耐药性的调控。3.同一地点分离菌株的耐药表型及CRISPR特征具有极高的相似性,且从菌株CRISPR中Spacer的分布特征可推测出菌株的过往生存环境。