【摘 要】
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目的:脑膜瘤是神经外科最常见的颅内肿瘤,其中恶性脑膜瘤治疗效果不佳,五年生存率约12%～57%,而目前尚无有效治疗恶性脑膜瘤的药物。ZYH005是同济医学院药学院新近合成的具有抗肿瘤潜力的菲啶酮衍生物。本研究目的在于明确菲啶酮衍生物ZYH005对恶性脑膜瘤的生物学作用,并对其机制进行初步探索。方法:采用CCK-8法检测ZYH005对人恶性脑膜瘤细胞及正常细胞增殖的影响。采用DAPI染色、流式细胞术
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目的:脑膜瘤是神经外科最常见的颅内肿瘤,其中恶性脑膜瘤治疗效果不佳,五年生存率约12%～57%,而目前尚无有效治疗恶性脑膜瘤的药物。ZYH005是同济医学院药学院新近合成的具有抗肿瘤潜力的菲啶酮衍生物。本研究目的在于明确菲啶酮衍生物ZYH005对恶性脑膜瘤的生物学作用,并对其机制进行初步探索。方法:采用CCK-8法检测ZYH005对人恶性脑膜瘤细胞及正常细胞增殖的影响。采用DAPI染色、流式细胞术检测ZYH005处理后人恶性脑膜瘤细胞的凋亡水平,采用Western blot检测药物处理后凋亡相关蛋白表达水平的变化。建立裸鼠皮下异种移植瘤模型,探索ZYH005在体内对人恶性脑膜瘤细胞IOMM-Lee的作用,对肿瘤体积、重量进行测量,采用Ki-67免疫荧光染色及TUNEL染色检测肿瘤组织的增殖情况和凋亡水平。采用单细胞凝胶电泳法检测ZYH005处理后人恶性脑膜瘤细胞DNA损伤水平,使用流式细胞术分析药物处理后其细胞周期变化,采用Western blot检测药物处理后DNA损伤反应及细胞周期相关蛋白的表达水平。采用划痕实验、Transwell侵袭实验检测ZYH005对人恶性脑膜瘤细胞和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）迁移、侵袭的影响。采用小管形成实验研究ZYH005对HUVEC小管形成能力的影响。采用人受体酪氨酸激酶磷酸化抗体芯片分析ZYH005处理后IOMM-Lee细胞受体酪氨酸激酶磷酸化水平的变化。结果:ZYH005处理细胞48 h后,恶性脑膜瘤细胞CH157-MN和IOMM-Lee的IC 50分别为0.071μM和0.050μM,而正常细胞SVG P12、NCM460和MEFs的IC 50分别为0.428μM、0.291μM、0.227μM。经ZYH005处理后行DAPI染色,可观察到细胞核固缩。流式细胞仪检测结果表明ZYH005处理72 h后CH157-MN和IOMM-Lee细胞的总凋亡率分别高达54.6%±3.0%和79.8%±3.2%。Western blot可检测到ZYH005处理后Cleaved PARP、Cleaved caspase-3上调,抗凋亡蛋白BCL-XL和促凋亡蛋白BAX的表达均不受影响。动物实验结果显示第28天时ZYH005组肿瘤体积、重量均显著低于对照组。同时ZYH005处理组的Ki-67阳性细胞占比低于对照组,而TUNEL阳性细胞占比高于对照组。单细胞凝胶电泳实验观察到经ZYH005处理的恶性脑膜瘤细胞出现彗星样拖尾现象,药物处理组尾DNA含量和尾长均显著大于对照组。Western blot分析结果显示,ZYH005能上调P-ATM和γ-H2AX的表达,下调BRCA1的表达,而对P-ATR和XRCC4的表达没有影响。流式细胞数检测细胞周期发现0.1μM ZYH005作用12 h时即能显著提高G2/M期细胞占比。Western blot分析结果显示,在ZYH005作用下,p21蛋白表达上调,CDK1及P-CDK1表达下调,而Cyclin A2、Cyclin B1的表达没有影响。ZYH005处理CH157-MN、IOMM-Lee和HUVEC细胞后能显著延迟划痕的愈合,减少侵袭细胞数。小管形成实验结果显示,ZYH005显著减少HUVEC小管总节点数和总节点长度。使用人受体酪氨酸激酶磷酸化抗体芯片分析发现,经ZYH005处理后恶性脑膜瘤细胞EGFR磷酸化水平明显下调。结论:ZYH005在体外实验和体内实验中均能抑制恶性脑膜瘤增殖,抑制作用与诱导细胞凋亡有关,其凋亡信号可能以非内源性途径传导。ZYH005可引起恶性脑膜瘤细胞发生DNA双链断裂损伤,并通过下调BRCA1表达水平来抑制同源重组修复DNA损伤。此外,ZYH005通过上调p21表达并抑制其下游CDK1的活性,进而导致恶性脑膜瘤细胞发生G2/M期阻滞和加剧DNA损伤。体外实验表明ZYH005可能通过下调EGFR磷酸化水平抑制恶性脑膜瘤细胞迁移、侵袭以及血管生成等恶性生物学行为。
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