线形泛素链组装复合物（LUBAC）是唯一已知的E3连接酶复合物,它由催化亚基HOIP和辅助亚基HOIL-1L和SHARPIN组成。SHARPIN与HOIL-1L的UBL结构域结合到HOIP的UBA结构域参与LUBAC的形成和稳定,但关于SHARPIN和HOIL-1L的UBL结构域的N末端在LUBAC的稳定中的作用尚未阐明。UBA结构域含有三个半胱氨酸位点,即Cys504、Cys551,和Cys572,其中Cys504和Cys551形成一对二硫键。二硫键是维持蛋白结构和功能完整性的重要结构元素之一,因此研究保守的二硫键对人UBA结构域生化特性的影响非常重要。本研究中,我们首先利用分子生物学方法构建了HOIP UBA结构域、HOIL-1L 1-140结构域、SHARPIN 1-127结构域、128-309结构域、UBL结构域的原核表达载体。利用SUMO表达系统与ULP酶在大肠杆菌中的共表达成功获得了大量可溶性目的蛋白。其次利用定点突变技术将UBA结构域中Cys突变为Ala,构建了三个UBA突变体,即UBAC551A、UBAC572A和UBAC551,572A。利用生物化学分析技术对目的蛋白的结构及生物学性质进行表征,阐明了HOIP、SHARPIN与HOIL-1L之间的作用关系,同时也揭示了二硫键对UBA结构域结构和生物学性质的影响。实验结果如下:（1）蛋白表达结果表明构建的所有目的蛋白都为可溶性表达。纯化结果表明所获得的目的蛋白产量、纯度高、结构稳定且都为单体蛋白。（2）二级结构分析结果表明共表达系统获得的目的蛋白都能够正确折叠且去除二硫键不会影响UBA结构域的二级结构。（3）热变性和脲变性结果表明,去除二硫键明显降低了UBA结构域的结构稳定性;同时证明了1-127结构域的稳定性高于128-309结构域和UBL结构域。（4）ANS荧光滴定实验结果表明去除二硫键略微增大了UBA结构域的疏水表面,从而提高蛋白质对配体的亲和力。（5）蛋白相互作用分析结果表明UBA结构域二硫键的去除并不影响与HOIL-1L的结合。此外证明了SHARPIN通过将UBL结构域与HOIP的UBA结构域结合参与LUBAC形成,并且SHARPIN的128-309结构域与HOIL-1L的1-140结构域也存在相互作用。（6）亲和力测定结果表明SHARPIN的128-309结构域与HOIP的UBA结构域的结合力强于UBL结构域。但当使用UBA结构域滴定128-309结构域与HOIL-1L的1-140结构域复合物时,三者之间的结合力变的更强。实验结果表明,SHARPIN通过UBL结构域与HOIP的UBA结构域参与LUBAC的形成,128-205片段与HOIL-1L的1-140结构域共折叠参与LUBAC的稳定。我们的结果为下一步解析128-309结构域/UBA结构域复合物和128-309结构域/HOIL-1L的1-140结构域复合物的晶体结构找到它们相互作用位点提供了基础。