【摘 要】
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[目 的]卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤,病死率居妇科恶性肿瘤首位。化疗作为目前卵巢癌的主要治疗,因其严重的副作用和获得性耐药而作用受限。血根碱是从白屈菜、博落回等天然植物中分离出来的苯并菲啶类生物碱,已有多项研究表明其具有抗肿瘤作用,但在卵巢癌的作用靶点及机制尚不清楚。本研究结合网络药理学方法和基因芯片技术,挖掘血根碱抗卵巢癌可能的作用靶点,探究血根碱抗卵巢癌的作用机制,为血根碱在卵巢癌的应用提供理
【基金项目】
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国家自然科学基金（81960469）； 昆明医科大学创新团队（CXTD202008）；
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[目 的]卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤,病死率居妇科恶性肿瘤首位。化疗作为目前卵巢癌的主要治疗,因其严重的副作用和获得性耐药而作用受限。血根碱是从白屈菜、博落回等天然植物中分离出来的苯并菲啶类生物碱,已有多项研究表明其具有抗肿瘤作用,但在卵巢癌的作用靶点及机制尚不清楚。本研究结合网络药理学方法和基因芯片技术,挖掘血根碱抗卵巢癌可能的作用靶点,探究血根碱抗卵巢癌的作用机制,为血根碱在卵巢癌的应用提供理论依据及实验基础,为天然药物的抗肿瘤研究提供新的思路。[方法]1.通过TCMSP数据库检测血根碱的吸收、分布、代谢、排泄（absorption,distribution,metabolism and excretion,ADME）属性,评估血根碱的可药用性。2.基于PharmMapper数据库预测与血根碱药效基团相匹配的靶点,GEO数据库筛选卵巢癌差异表达基因（differential expression genes,DEGs）,韦恩图寻找血根碱预测靶点和卵巢癌DEGs的共同基因作为血根碱作用于卵巢癌的潜在靶基因。3.培养卵巢癌OVCAR3和SKOV3细胞,2.0umol/L血根碱处理48小时,基因芯片检测血根碱组和对照组卵巢癌SKOV3和OVCAR3细胞的基因表达情况,在基因芯片结果中检索上述韦恩图得到的共同基因。4.Kaplan-Meier Plotter获取基因芯片检索的共同基因在卵巢癌患者中的总生存期（overall survival,OS）和无进展生存期（progression free survival,PFS）信息,分析这些基因对卵巢癌患者预后的影响;同时Oncomine数据库挖掘上述基因在卵巢癌组织和正常组织中的表达情况。结合Kaplan-Meier生存分析和Oncomine基因表达情况筛选出关键基因。5.实时荧光定量PCR法和Western Blot分别检测血根碱抗卵巢癌细胞靶基因CHEK1和KIF11 mRNA和蛋白表达水平。[结果]1.血根碱的口服生物利用度（oral bioavailability,OB）和药物相似性（drug likeness,DL）分别为37.81%和0.86,说明血根碱具有良好的溶解性和稳定性,可作为中药的有效药物成分。2.通过PharmMapper挖掘发现可与血根碱药效基团结合的靶点207个,经UniProt数据库标准化命名并删除重复值后,共预测了 201个血根碱作用靶点。GEO数据库下载卵巢癌数据集GSE14407,经GEO2R在线处理并筛选,获得1445个卵巢癌DEGs,其中上调基因769个,下调基因676个。韦恩图得到了 27个血根碱预测靶点与卵巢癌DEGs的共同基因。3.血根碱处理卵巢癌细胞后,基因芯片检测血根碱组与对照组的DEGs,共有3487个有统计学意义的DEGs,其中上调基因1701个,下调基因1786个。在3487个DEGs中检索韦恩图得到的27个共同基因,最终筛选到5个基因,分别为CHEK1、KIF11、ADH5、PDE4D、BMP2。基因芯片结果显示,血根碱处理后SKOV3和OVCAR3细胞中CHEK1、KIF11和ADH5的表达下调,BMP2和PDE4D的表达上调（P＜0.05）。4.Kaplan-Meier生存分析结果发现,CHEK1、KIF11和ADH5高表达的卵巢癌患者OS与PFS低于低表达患者,表达愈高预后愈差（P＜0.05）,而PDE4D高表达的卵巢癌患者OS和PFS较长,差异有统计意义（P＜0.05）;BMP2高表达的患者OS短于低表达患者,但PFS未表现出明显差异（P＞0.05）。Oncomine数据库对CHEK1、KIF11、ADH5、PDE4D、BMP2在卵巢癌中的表达分析显示,与正常卵巢组织相比,卵巢癌组织中CHEK1、KIF11和PDE4D的转录水平显著升高,ADH5和BMP2的转录水平降低。结合基因芯片、生存分析和卵巢癌组织中的基因表达情况,选择CHEK1和KIF11为血根碱的靶点进行细胞实验验证血根碱对其水平的影响。5.RT-qPCR和Western Blot检测结果显示,血根碱组CHEK1和KIF11 mRNA及蛋白的表达均显著低于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）。[结论]1.CHEK1和KIF11在卵巢癌中呈高表达,且与卵巢癌患者的不良预后相关,CHEK1和KIF11基因在卵巢癌中发挥着癌基因的作用。2.血根碱抗卵巢癌作用可能与下调CHEK1和KIF11的表达相关,但具体机制仍需进一步的实验证实。3.联合应用网络药理学、基因芯片技术、癌症基因数据库、生存分析以及细胞实验等手段挖掘天然药物抗肿瘤的潜在靶点,探究其作用机制是可行和有效的,对天然产物的研究及开发具有重要意义。
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