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心脏移植已成为终末期心脏病有效的治疗方式,免疫抑制剂是治疗急性排斥反应的最主要手段,随着免疫抑制疗法的改善,在患者出院至移植后1年之间,急性排斥反应的发生率持续下降,但全身应用免疫抑制剂不可避免引起一系列并发症,如感染、恶性肿瘤和肾脏毒性等,严重影响患者预后。如何局部靶向递送免疫抑制剂,是近年来移植物排斥反应研究的主要关注点。超声靶向微泡破坏技术（Ultrasoundtargeted microbubble destruction,UTMD）作为一种基因递送和转染的新技术,可靶向爆破超声微泡,并在靶器官释放治疗性基因。同时产生空化效应,增强局部血管及细胞膜通透性,促进基因在组织内渗透及细胞摄取,从而实现基因体内靶向递送并增强疗效。本研究旨在制备一种载antagomir-155（miRNA-155抑制剂）的阳离子微泡,在UTMD介导下靶向递送至心肌组织,以治疗心脏移植急性排斥反应。本研究包括以下两部分:第一部分载antagomir-155阳离子微泡的制备、表征及安全性评价目的制备载antagomir-155的阳离子微泡,并评估其表征和参数安全性。方法1.薄膜水化-机械振荡法制备阳离子微泡（mL）,在制备后即刻、3小时、6小时、24小时分别检测mL的粒径、电位和浓度,以评估其稳定性。2.将HUVEC与浓度分别为1×109 mL-1、1×109 mL-1、2×109 mL-1、3×109 mL-1、4×109 mL-1、5×109 mL-1的mL共孵育,测算在共孵育1小时、24小时后的细胞存活率,以评估mL对细胞的毒性作用。3.制备阳离子微泡（mL）和带Cy3荧光的载antagomir-155的阳离子微泡（antagomir-155@mL）,在肉眼和荧光显微镜下观察两者的形态。4.使用电位粒度分析仪测量未载antagomir-155的阳离子微泡和载antagomir-155的阳离子微泡的粒径和Zeta电位。5.利用荧光光度计,用间接法测量不同浓度梯度混悬液带Cy3荧光的antagmir-155含量,计算出单个阳离子微泡上antagomir-155的载量。6.用超声击破微泡（UTMD）,测量阳离子微泡释放antagomir-155的动力学参数。7.分别用超声辐照移植心1分钟、2分钟、3分钟,以无辐照为对照组,监测移植心率;分别以生理盐水（saline）、阳离子微泡（mL）及UTMD处理健康小鼠心脏,在第1天与第7天检测其血生化及血常规,并将主要脏器切片做HE染色。结果1.在制备后的24小时内,mL的浓度及Zeta电位相对稳定;在制备后的6小时内,mL的粒径相对稳定。随着时间的延长,mL的浓度、Zeta电位和粒径发生变化,在制备后的第24小时,mL浓度变为初始浓度的70.2%,电位变为初始Zeta电位的64.7%,粒径变为初始粒径的130.0%。2.1×109 mL-1、1×109 mL-1、2×109 mL-1、3×109 mL-1、4×109 mL-1、5×109 mL-1的mL与HUVEC共孵育1小时、24小时后,与对照组（PBS）相比,HUVEC的细胞存活率分别为92.7±10.4%,94.7±3.3%,94.4±3.7%,95.0±3.2%,99.3±6.2%,其细胞存活率与对照组无明显差异。mL与HUVEC共孵育24小时后,HUVEC的细胞存活率分别为92.5±20.9%,92.8±3.7%,84.6±11.9%,80.0±7.5%,80.8±10.%,其细胞存活率与对照组无明显差异（P＞0.05）。3.肉眼观下,mL为乳白色悬浊液,与带Cy3荧光的antagomir-155共孵育后,其肉眼观为淡粉色悬浊液。荧光显微镜显示antagomir-155@mL微泡表面呈现红色荧光,而mL无明显荧光。4.mL的粒径为1206.8±20.4 nm,而antagomir-155@mL的粒径为1119.3±33.7nm,二者粒径有统计学差异（P＜0.05）。mL的Zeta电位为11.6±1.5 m V,antagomir-155@mL的Zeta电位为-5.3±0.3 m V,二者有统计学差异（P＜0.05）。5.当antagomir-155浓度为0.5 nmol时,单个c MB上antagomir-155载量为1.1±1.0×106;当antagomir-155浓度为1.0 nmol时,其载量为1.4±0.3×106;当antagomir-155浓度为1.5 nmol时,其载量为1.5±0.4×106;当antagomir-155浓度为2.0 nmol时,其载量为1.6±0.5×106。6.超声作用后即刻测量,溶液中游离antagomir-155的量显著增加（P＜0.05）,较对照组升高约20倍;30s后,UTMD组溶液中antagomir-155浓度较前没有明显变化（P＞0.05）,60s后,UTMD组溶液中antagomir-155浓度较30s时间点没有明显变化（P＞0.05）。7.超声辐照移植心1分钟、2分钟后,与对照组（无辐照）相比,心率无明显变化（P＞0.05）,而在超声辐照3分钟后,心率降到对照组心率的71.3%;Saline、mL、UTMD处理过的健康小鼠第1、7天血常规及血生化无明显变化（P＞0.05）,其主要脏器HE染色显示无明显病理性改变。结论本研究成功制备了理化性质稳定的载antagomir-155阳离子微泡,并验证了其联合超声靶向微泡破坏技术安全性,为下一步超声介导的靶向治疗奠定了基础。第二部分心脏移植急性排斥反应动物建模及疗效评价目的建立稳定的小鼠腹腔异位心脏移植模型,并评估超声介导载antagomir-155微泡靶向治疗心脏移植急性排斥反应的疗效。方法1.以Balb/C（H-2d）小鼠淋巴细胞作为反应细胞,C57/BL6J（H-2b）小鼠淋巴细胞作为刺激细胞,进行混合淋巴细胞反应;在混合淋巴细胞反应中加入antagomir-155,测算反应细胞的抑制程度,并以q-PCR检测细胞中miRNA-155水平,以评估antagomir-155在体外抑制反应的疗效。2.以Balb/C（H-2d）小鼠作为供体,C57/BL6J（H-2b）小鼠作为受体,作为急性排斥反应组;57/BL6J（H-2b）小鼠作为供体,C57/BL6J（H-2b）小鼠作为受体作为同系对照组,观察两组移植心的生存时间;在心脏移植后7天,观察移植物心脏排斥反应病理变化。3.建立小鼠腹腔异位心脏移植模型,分别给予生理盐水（saline组）、单纯antagomir-155（antagomir-155组）、载antagomir-155阳离子微泡联合超声治疗（antagomir-155@mL+US组）。在干预后的1小时及24小时取将移植心与主要脏器,在小动物活体成像仪下观察antagomir-155的生物分布并定量分析。然后将移植心冰冻切片,在荧光显微镜下观察三组的荧光强度并定量分析。4.建立小鼠腹腔异位心脏移植模型,分别给予生理盐水（saline）、单纯antagomir-155（antagomir-155）、载antagomir-155阳离子微泡联合超声治疗（antagomir-155@mL+US）,在干预后的第7天取移植心做HE染色评估急性排斥反应程度,并行CD45免疫组化染色评估炎性细胞浸润程度;qt-PCR检测其miRNA-155、IL-6、IL-2、IFN-γ、TNF-α基因水平;Western Blotting检测其PU.1、IL-6、IL-2、IFN-γ、TNF-α蛋白水平。5.分别记录上述三种处理方式（saline组、antagomir-155组、antagomir-155@mL+US组）,移植心存活时间。结果1.在antaogmir-155干预下,反应细胞增殖抑制,且细胞中miRNA-155水平下降。2.急性排斥反应组（Allogeneic）平均生存时间为6.5±1.5天,而同系对照组（Syngeneic）平均生存时间＞100天。术第7天急性排斥反应组病理切片显示排斥反应明显,同系对照组中未见排斥反应征象。3.在干预1小时、24小时后,荧光显微镜观察移植心横切面,antagomir-155@mL+US组可见明显红色荧光,antagomir-155组可见少量点状微弱的红色荧光,而saline组未见明显红色荧光。4.离体器官的小动物活体荧光成像显示,antagomir-155@mL+US组的移植心荧光定量显著高于saline组和antagomir-155组;在antagomir-155@mL+US和antagomir-155组中,肝脏为荧光最强的器官,saline组中各器官未见荧光分布。5.在干预后的第7天,q-PCR结果显示antagomir-155@mL+US组中miRNA-155、IL-6、IL-2、IFN-γ、TNF-α的表达量均明显低于saline组与antagomir-155组;Western Blotting结果显示antagomir-155@mL+US组中炎性因子IL-6、IL-2、IFN-γ、TNF-α蛋白的表达量均明显低于saline组与antagomir-155组,而PU.1蛋白在antagomir-155@mL+US组中的表达量明显高于saline组与antagomir-155组。6.HE染色显示antagomir-155@mL+US组移植心ACR程度较antagomir-155组和saline组明显减弱,CD45免疫组化染色显示antagomir-155@mL+US组移植心内炎性细胞浸润程度较antagomir-155组和saline组明显减弱。7.生存期统计结果显示,antagomir-155@mL+US组移植心脏的存活时间（15.17±5.85天）较saline组（6.67±1.03天）与antagomir-155组（8.67±2.42天）明显延长。结论本研究制备的小鼠腹腔异位心脏移植模型,能较好地反映心脏移植急性排斥反应的病理变化,可以用于心脏移植的研究;本研究发现载antagomir-155阳离子微泡联合超声,可显著增加心脏中antagomir-155的浓度,提高PU.1表达,并抑制IL-6、IL-2、IFN-γ、TNF-α表达,从而明显降低ACR程度,延长移植心存活时间。本研究成果为心脏移植排斥反应靶向治疗提供了新思路。