胶质瘤是脑内发病率最高的恶性肿瘤,由于瘤体组织浸润入脑实质,手术,放、化疗均不能取得满意效果,平均存活期只有10-15个月,寻求生物治疗手段具有现实意义[1,2]。如今,脑已经不再被认为是一个免疫豁免器官,多种细胞运行途径已被阐明,而且疾病状态下血脑屏障(BBB)多被破坏,胶质瘤细胞可以表达主要组织相容性复合体(MHC)分子,脑内有抗原递呈细胞(APC)的存在,这些结构基础使得脑内发生免疫反应成为可能[3-6]。至今已有若干针对胶质瘤的免疫治疗的研究,不论使用主动或被动免疫手段,激发有效免疫的治疗手段由于具有对肿瘤细胞的特异性,尤其值得深入研究[7],但迄今为止,效果仍难以令人满意,主要原因是难以寻找到非常特异的肿瘤抗原(TSA)以及患者体内存在的多种免疫抑制途径。主要的免疫抑制有免疫抑制细胞以及瘤组织外泌或组成性表达的免疫抑制因子等。对胶质瘤的免疫状态研究表明,除了胶质瘤患者外周及瘤体中TGF-p, IL-6, IL-10,PGE2等诸多免疫抑制因子的存在,辅助性T亚群细胞亦呈失衡趋势。Th1型细胞因子IFN-γ表达下降,而IL-6在几乎所有胶质瘤细胞系及临床标本中均现高表达,胶质瘤患者同时高表达具有明显免疫抑制作用的Treg亚群等。Th17细胞是辅助性T细胞亚群的新成员[8,9],目前Th17型细胞及因子在胶质瘤中的作用还处在空白状态。Th17细胞最初在自身免疫性疾病研究中被发现,该群细胞表达CD4和IL-17。初始CD4+细胞受到TGF-β和IL-6影响[10,11]依赖转录因子RORγt而分化为Th17细胞[12,13], IL-23, IL-1β等细胞因子也被认为与该亚群细胞分化及功能有关。该群细胞在感染和自身免疫性疾病中作用得到了广泛研究,主要通过表达IL-17及诱导趋化因子表达诱导感染防御,诱发持续炎症等病理过程。同时,该群细胞在肿瘤中的作用也得到了极大关注,目前Th17细胞主要效应分子IL-17被证实至少通过以下几种方式促进肿瘤：1).上调VEGF、CD31等因子表达,从而促进血管增生,加速肿瘤生长；2).上调IL-6,STAT3信号途径促进肿瘤进展；3).下调Thl表面IL-12Rβ2分子表达,从而下调Th1细胞功能,抵抗有效肿瘤免疫；4).使CD8+细胞共表达IL-17,从而失去细胞毒效应,抗凋亡[14-16]。目前的研究认为,肿瘤微环境中存在的IL-6, TGF-β, IL-23, IL-1β对该亚群分化具有支持作用,而肿瘤细胞表达的RANTES及MCP-1分子则对该亚群细胞具有趋化作用[17],导致该亚群细胞在局部聚集,并有可能在肿瘤发展中有重要作用。因此,阐明胶质瘤患者Th17亚群表达、分化及可能的肿瘤免疫作用是认识胶质瘤患者辅助性T细胞亚群状态不可缺少的一部分,为认识胶质瘤免疫抑制机制从而寻找有效的免疫治疗手段提供理论基础。本研究从胶质瘤患者外周及肿瘤微环境Th17细胞及相关因子的表达水平入手,进而分析胶质瘤时该亚群细胞的分化机制以及该亚群细胞在胶质瘤肿瘤免疫中可能的作用,均取得了可靠实验结果,分述如下：1).胶质瘤患者Th17细胞及相关细胞因子表达分析本部分旨在分析胶质瘤患者外周及肿瘤局部Th17细胞及相关细胞因子表达情况。本研究分析了35份胶质瘤及20份健康体检者外周血标本中CD4+IL-17+/CD4+细胞比例,以及血浆中IL-17, IL-23, IL-6, TGF-p, IFN-y浓度。同时,分析了24份胶质瘤及5份脑外伤组织中IL-17,RORC,IL-23,IL-6,TGF-β,IFN-y, IL-1βmRNA表达。胶质瘤患者外周血CD4+IL-17+/CD4+比例,血浆中IL-17, IL-23, IL-6, TGF-p, IFN-y浓度与健康体检者比较无明显差异。而胶质瘤标本中IL-17, RORC mRNA呈高阳性率,相比之下,5例脑外伤组织中IL-17, RORCmRNA均阴性。所有胶质瘤及脑外伤组织IL-23均阴性表达,而IL-1β则在大部分的标本中阳性表达,相比无显著性差异。IL-6, IFN-y在胶质瘤及外伤组织标本中均呈不同阳性表达,相比无显著性差异。TGF-β则在外伤及低级别(gradeⅡ)胶质瘤中表达高于高级别胶质瘤组织(gradeⅣ) (p<0.05)。之后,用免疫组化方法分析了15份IL-17 mRNA阳性胶质瘤标本IL-17蛋白水平表达,所有标本均呈阳性结果,阳性区域可见于胞内,也可见于胞外。2).IL-17对胶质瘤细胞株U87MG致瘤效应的研究在取得第一部分试验结果的基础上,本研究进一步通过动物实验分析了Th17亚群细胞主要的效应分子IL-17对胶质瘤细胞株成瘤效应的影响。我们首先构建了真核表达载体pEGFP-N1-IL-17,与pEGFP-N1质粒分别转染入U87MG细胞株,单克隆筛选阳性细胞株后扩大培养,在荧光、mRNA及蛋白水平鉴定IL-17表达阳性后。pEGFP-N1-IL-17-U87MG、pEGFP-N1-U87MG、U87MG调整细胞数为5×105,种植至6周龄裸鼠皮下(每组10只),观察成瘤效应。分别在32D,37D及39D测量肿瘤体积(V=ab2/2)。结果表明,pEGFP-N1-U87MG组只有3/5小鼠成瘤,并且在各个时间段瘤体积均小于pEGFP-N1-IL-17-U87MG及U87MG组(p<0.01), pEGFP-N 1-IL-17-U87MG及U87MG组所有裸鼠均成瘤,pEGFP-N1-IL-17-U87MG组较U87MG组在32D天时瘤体积增大(p<0.05),37D及39D时体积均值大于U87MG组,但无显著性差异。39天时裸鼠脾体积与瘤体积呈相似改变,pEGFP-N1-IL-17-U87MG, U87MG组较pEGFP-N1-U87MG组脾体积大(p<0.05), Real time PCR对瘤组织CXCR2, CD31分析表明,pEGFP-N1-IL-17-U87MG组CD31表达较pEGFP-N1-U87MG、U87MG组均升高(p<0.01), pEGFP-N1-U87MG与U87MG组CD31无差异,相似的结果见于切片CD31染色后血管计数,pEGFP-N1-IL-17-U87MG较pEGFP-N1-U87MG及U87MG每高倍镜下血管数比较有明显增多(p<0.01), CXCR2上述三组间表达无差异。之后,为了阐明IL-17促进U87MG细胞株成瘤的效应,对pEGFP-N1-IL-17-U87MG、pEGFP-N1-U87MG、U87MG三细胞株应用定量PCR法检测各组趋化因子(CXCL1, CXCL5, CXCL8, CXCL10, CXCL11, MCP-1(CCL2), RANTES(CCL5), CCL20, CCR4, CCR6)、免疫调节因子(β2-MG, PD-L1, PGE2, TGF-β, IL-6, STAT3),血管相关分子(MMP3, ICAM-1,VEGF)表达差异。结果表明,三细胞株之间存在多种细胞因子的表达差异。pEGFP-N1-IL-17-U87MG及pEGFP-N1-U87MG组较U87MG组CXCL10、CCL20升高,pEGFP-N1-U87MG组较pEGFP-N1-IL-17-U87MG组MCP-1升高,后者与U87MG组无显著差异。除IL-6三组之间无差异外,其余免疫调节相关分子(β2-MG, PD-L1, PGE2, TGF-β, STAT3)三组之间均存在不同程度表达差异。而细胞间粘附分子中,pEGFP-Nl-U87MG组较其他两组MMP3,ICAM-1表达上调。3).胶质瘤细胞株U87MG培养上清液对Naive CD4细胞极化为Th17细胞的影响肿瘤和免疫系统的作用是相互的,之前的实验观察到了胶质瘤较外伤脑组织中有更高的IL-17表达阳性率,IL-17主要来源于Th17细胞,而且第二部分的实验结果表明,IL-17过表达对胶质瘤细胞株U87MG种植瘤有加速成瘤效应,本部分旨在观察U87MG细胞株是否对Naive CD4细胞极化成Th17细胞存在影响。血站购买外周血PBMC (1×108),经免疫磁珠法负选后得到Naive CD4细胞(1×106),将U87MG培养上清液以1/5比例加至Naive CD4细胞培养液中,置已包被有anti-hCD3抗体的培养版中,同时添加anti-hCD28及IL-2,3天后换液,7天后流式检测4个亚群(Th1, Th2, Th17, Treg)细胞比例。结果表明,添加1/5量U87MG培养上清组较对照组Th2亚群细胞比例降低(p<0.05),Thl亚群亦降低,但无显著性差异,Treg, Th17亚群各组之间无显著性差异。上述实验结果表明,胶质瘤组织中IL-17, RORC较外伤组织表达阳性率高,除此之外,TGF-β在外伤脑组织及gradeⅡ胶质瘤中较gradeⅣ胶质瘤组织中表达阳性率高。IL-17过表达对U87MG细胞成瘤具有加速效应, IL-17过表达能促进种植瘤血管生成。而单独的U87MG肿瘤细胞外泌分子不足以引起Naive CD4+细胞向Th17细胞极化。