食管癌为常见的消化道恶性肿瘤之一,全球发病率和病死率分别居全部恶性肿瘤的第8位和第6位,2020年全球新发病例约60.4万。该病恶性程度高、扩散快、预后差,早期症状隐匿,发现时往往已处于癌症晚期,易错失最佳治疗时间,致死率高。随着科学技术的发展,目前形成了以根治性手术、放射治疗以及化学治疗为主,晚期病人辅以靶向治疗或免疫治疗的新治疗模式。但食管癌患者的五年生存率仍不足20%,因此,对食管癌的发病机制进行深入研究,寻找更敏感的早期诊断标志物和更为有效的抗肿瘤分子靶点成为当前诊治食管癌的迫切需求。RRP9（ribosomal RNA processing 9,U3 small nucleolar RNA binding protein）,也称为U3-55K,编码于人类染色体3p21.2（Cléry等,2007）是一种RNA结合蛋白。RRP9蛋白是WD重复蛋白家族的一员,大小为475个氨基酸。通过结晶学方法,研究人员发现RRP9蛋白由一个N末端区域和一个WD重复结构域组成,而WD结构域由一个典型的七叶螺旋桨折叠组成。snoRNA（核仁小RNA）是一类广泛存在于真核生物细胞核仁的小分子非编码RNA。snoRNA包含特异的核酸序列与空间结构,根据特定的核酸基序,snoRNA主要分为C/D box和H/ACA box两种类型。而C/D snoRNA主要参与核糖体RNA的修饰。U3是特殊的C/D snoRNA,它和18S核糖体RNA的加工和核糖体小亚基的合成有关。在真核细胞中,U3和RRP9蛋白是早期pre-rRNA裂解的必需蛋白,对于18S核糖体RNA的加工和核糖体小亚基的合成有不可或缺的作用。已有研究表明RRP9异位表达可促进结直肠癌肿瘤细胞增殖、集落和迁移,且RRP9和Smurfl的异常表达与肿瘤进展相关。但RRP9在其他恶性肿瘤中的作用研究仍较少。关于RRP9在食管癌中的表达及其与预后的关系尚不清楚,且RRP9在食管癌发生发展中的功能及机制尚无深入研究。鉴此,我们结合临床资料、RNAi技术及体内、外实验等方法,从临床标本、细胞、动物水平研究了 RRP9在食管癌中的作用,发现RRP9的表达与食管癌的发生发展密切相关。第一部分RRP9在食管癌组织中的表达及临床意义研究目的通过免疫组化分析RRP9在人食管癌组织和癌旁正常食管黏膜组织中的表达情况,揭示RRP9表达水平与相关临床病理参数之间的关系,进而明确RRP9与食管癌患者预后的关系。研究方法1.以2016-2019年收治的食管癌患者为对象,经病人知情同意收集手术食管癌切除标本,其中包含358例肿瘤组织样本和119例癌旁组织样本。所有患者均无其他原发肿瘤;为首次接受病变切除术;在术前未接受新辅助-化疗等抗肿瘤治疗。对患者的性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期、常规病理结果等临床资料进行统计。2.利用免疫组化染色法检测食管癌组织和癌旁组织切片中RRP9的表达水平。3.使用χ2检测RRP9在临床样本和正常组织样本中的表达差异。应用Spearman相关性检验明确RRP9表达水平与病人年龄、性别、TNM分期、病理学分期等临床特征的相关性。4.采用Kaplan-Meier分析和log-rank检验确定RRP9不同表达水平对患者总生存的影响。研究结果1.免疫组化结果显示,食管癌组织中RRP9表达水平明显高于癌旁组织,358例临床食管癌组织标本中,50%（179/358）标本中RRP9表达水平明显增加。且RRP9主要表达在细胞核中。2.Spearman相关性检验结果显示,RRP9在食管癌组织中的表达水平与年龄（P＜0.05）、肿瘤大小（P＜0.05）、T值（P＜0.05）、肿瘤淋巴结转移（N值）（P＜0.05）及病理分期（P＜0.05）具有统计学相关性,阳性淋巴结的数目（P=0.260）或EC病理评分（P=0.170）与RRP9表达水平无明显关联。RRP9是否高表达与肿瘤是否转移无关（P=0.287）。3.Kaplan-Meier分析和log-rank检验绘制生存曲线,结果表明RRP9低表达的食管癌患者生存率显著高于RRP9高表达的食管癌患者。结论1.RRP9的表达水平在食管癌组织中显著增高。2.RRP9在食管癌组织中的表达水平与患者年龄、肿瘤大小、T值、肿瘤淋巴结转移及病理分期有显著的相关性。3.食管癌患者RRP9的表达水平与患者总体生存时间存在负相关的关系。第二部分RRP9对食管癌细胞恶性生物学行为的调控作用及机制研究目的探究RRP9对食管癌细胞增殖、凋亡、细胞周期及迁移、侵袭能力的影响,并进一步挖掘RRP9调控食管癌细胞恶性生物学行为的分子机制,为评价RRP9作为一种新的食管癌诊断标志物和治疗靶点的可行性提供数据支持。研究方法1.检测Eca-109、EC9706、KYSE450、TE-1四种食管癌细胞系和HEEC正常食管黏膜细胞中RRP9的mRNA表达水平。选取表达较高水平RRP9的食管癌细胞株为研究对象,利用敲降RRP9（shRRP9）的慢病毒和对照病毒（shCtrl）分别感染细胞,构建稳定敲低RRP9的细胞株及阴性对照细胞株。2.通过qPCR和蛋白质免疫印迹法（western blotting）检测上述构建的稳转细胞系中RRP9mRNA与蛋白表达水平,从而明确敲减效率。3.稳定敲减RRP9对食管癌细胞的增殖能力的影响通过Celigo cell counting检测。4.稳定敲低RRP9细胞系的迁移能力通过划痕实验和Transwell实验检测。5.通过流式细胞术检测敲低RRP9对食管癌细胞凋亡和细胞周期分布的影响。6.将稳定敲低RRP9表达的细胞和阴性对照细胞注射到裸鼠体内,检测敲减RRP9在体内对食管癌细胞体内成瘤能力的影响。7.对稳定敲低RRP9的Eca-109细胞株与其对照细胞,通过RNA测序进行转录谱分析,鉴定出所有差异表达基因（DEGs）。通过IPA（ingenuity pathway analysis）分析软件对差异表达基因进行疾病与功能中的富集,并构建与RRP9相关的分子相互作用网络,预测与RRP9相关的核心基因。8.通过qPCR和WB实验验证目标基因与RRP9的关系。研究结果1.构建了稳定敲低RRP9的细胞株（Eca-109/shRRP9和TE-1/shRRP9）及对应的阴性对照组。2.Celigocellcounting检测表明,敲减RRP9基因后,Eca-109和TE-1细胞株的细胞增殖能力受到了显著的抑制（P＜0.05）。3.Transwell实验和划痕实验显示敲低RRP9基因表达后,抑制了肿瘤细胞的迁移能力。4.敲减RRP9组与阴性对照相比,凋亡细胞数量显著增加（Eca-109细胞,P＜0.001;T-1细胞,P＜0.001）;在Eca-109以及TE-1两种细胞中敲减RRP9后食管癌细胞G1期细胞数量（Eca-109细胞,P＜0.01;TE-1细胞,P＜0.001）和G2期细胞数量显著增加（Eca-109细胞,P＜0.001;TE-1细胞,P＜0.001）,S期细胞明显减少（Eca-109细胞,P＜0.001;TE-1细胞,P＜0.001）。提示RRP9缺失可阻断细胞在G1/S期的周期,同时也对食管癌细胞的凋亡起促进作用。5.在裸鼠体内实验模型中,与对照组相比,低表达RRP9组裸鼠肿瘤生长速度较慢、肿瘤体积较小（P＜0.05）。在处死裸鼠前,对裸鼠进行活体荧光成像,其结果显示RRP9敲减后的细胞所形成的肿瘤较对照组在体内生长缓慢。6.RNA转录测序得到RRP9差异表达基因4305个,包括上调基因2636个,下调基因1669个。在IPA分析软件中,对差异表达基因进行疾病与功能中的富集,并构建与RRP9相关的分子相互作用网络。结果示:RRP9在肿瘤发生发展中具有重要作用。分子互作网络提取可能与RRP9相互作用的核心基因17个,分别为ESC02,RAP1A,CDK1,FAM111B,SMC2,CCNL1,EZH2,EIF4A2,SGOL2,CASP4,CENPE,SMC4,KNTC1,CENPF,FANCM,HMMR,MAT2A。7.qPCR和Western blot显示,较之于对照细胞,CDK1和SMC2在Eca-109/shRRP9细胞中表达水平显著下调。结论1.干扰RRP9表达可抑制食管癌细胞的增殖、迁移能力。2.干扰RRP9表达可诱导食管癌细胞周期阻滞,促进食管癌细胞凋亡。3.RRP9调控食管癌细胞恶性生物学行为的发生可能是由CDK1和SMC2介导的。