【摘 要】
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肝癌是最常见的癌症之一,由于其转移性高、异质性强等特点传统的放化疗治疗效果并不显著,其致死率仅次于肺癌排名第二。CD44是一种跨膜糖蛋白,其在多种肿瘤细胞中显著高表达。已有文献报道CD44蛋白可以促进肿瘤细胞的迁移运动能力,但是其N-糖基化修饰对CD44蛋白功能及肿瘤的影响研究较少。课题组前期发现当CD44蛋白的6个N-糖基化位点完全突变（CD44M）后,其在Hela和SK两种细胞系中蛋白定位发生
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肝癌是最常见的癌症之一,由于其转移性高、异质性强等特点传统的放化疗治疗效果并不显著,其致死率仅次于肺癌排名第二。CD44是一种跨膜糖蛋白,其在多种肿瘤细胞中显著高表达。已有文献报道CD44蛋白可以促进肿瘤细胞的迁移运动能力,但是其N-糖基化修饰对CD44蛋白功能及肿瘤的影响研究较少。课题组前期发现当CD44蛋白的6个N-糖基化位点完全突变（CD44M）后,其在Hela和SK两种细胞系中蛋白定位发生改变。在此基础上,本研究进一步探讨N-糖基化位点突变对CD44蛋白定位及功能的影响,并对定位改变的机制进行初步探究。本研究首先将CD44野生型和CD44糖基化位点突变型CD44M瞬转到HUH7和97H细胞系中,发现与野生型相比N-糖基化位点全突变后CD44M蛋白定位在细胞质中。为了进一步确认影响蛋白定位的糖基化位点组合,研究了6种糖基化位点单点突变后蛋白的定位情况,发现与单点突变CD44-N25Q、CD44-N120Q和CD44-N255Q相比单点突变CD44-N57Q、CD44-N100Q、CD44-N110Q后CD44蛋白的膜定位不明显并且能看出微弱的细胞质定位。推测糖基化位点57、100和110对蛋白的定位至关重要。在此基础上对这三个糖基化位点两两组合进行研究,发现双糖基化位点突变的细胞中,部分CD44突变蛋白定位在细胞膜上,部分在细胞质中。我们又进行了三糖基化位点联合突变对蛋白定位进行研究,发现CD44-N57Q/N100Q/N110Q的三位点突变蛋白完全定位在细胞质中,而CD44-N25Q/N120Q/N255Q的三位点突变蛋白完全定位在细胞膜。该结果表明CD44通过57、100和110三个糖基化位点联合作用导致其定位从细胞膜到细胞质中。在三点联合突变（CD44-N57Q/N100Q/N110Q）改变定位的基础上,我们进一步探究了突变的N-糖链对CD44蛋白功能的影响。将p LVSIN-CD44、p LVSIN-CD44M、CD44-N25Q/N120Q/N255Q、CD44-N57Q/N100Q/N110Q和p LVSIN-EGFP重组质粒瞬转到HUH7和97H两种细胞系中,进行细胞划痕和细胞小室实验。划痕实验和小室实验结果用image J软件进行处理分析后利用Prism绘图。结果表明与p LVSIN-EGFP组相比,CD44和三点突变（N25Q/N120Q/N255Q）的两种肝癌细胞的迁移运动能力得到显著提升。而CD44M和三点突变（N57Q/N100Q/N110Q）后癌细胞的运动能力没有改变。以上结果提示,三点突变（N57Q/N100Q/N110Q）的CD44的蛋白功能确实发生变化,不再促进肝癌细胞的迁移能力。最后,我们对糖基化位点突变改变CD44定位的机制进行了初步研究。由于N-糖基化修饰是在内质网中开始加工的,因此选择CD44、CD44M及其N-糖基化位点三点联合突变CD44-N57Q/N100Q/N110Q与内质网驻留蛋白KDEL进行共定位研究。在97H细胞中,免疫荧光结果发现二者确实存在一定的共定位。在此基础上,利用CO-IP结合质谱的方法获得CD44蛋白的互作蛋白,结果表明与CD44M组和CD44-N57Q/N100Q/N110Q组相比,CD44组中特异存在RPL5蛋白以及TUBB、ACTB、RPL4、HSPA5等25个蛋白肽段增多。GO功能富集分析发现这些蛋白主要调节伪足的形成和维持蛋白的定位。推测这些蛋白可能与CD44蛋白的膜定位密切相关。本文从糖生物学的角度探讨了影响CD44膜定位的N-糖基化位点组合,并在此基础上对其功能和定位改变的机制进行了初步研究。其结果将进一步推动CD44糖链功能的研究,并为肝癌转移的治疗提供一个新的思路。
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