本研究包括一种外切α-1,4-糖苷酶的酶学表征和模式菌内源蛋白酶底物特异性研究两个部分。1、一种外切α-1,4-糖苷酶的酶学表征淀粉分为直链淀粉和支链淀粉两种,一般的淀粉中都含有α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键连接,支链淀粉中α-1,6-糖苷键连接更多。为了提高淀粉水解糖的效率,分离筛选到一种同时降解α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键的水解酶具有重要的应用价值。本研究前期已经筛选到一株产碱性淀粉酶的嗜碱芽孢杆菌703,该菌的同源株嗜碱芽孢杆菌OF4已经全基因组测序。本研究以OF4基因组信息设计引物,以703为模板,通过PCR克隆得到一个外切α-1,4-糖苷酶基因,命名为amy112,该基因编码蛋白的氨基酸序列进行比对分析发现Amy112属于糖基水解酶13家族,同Geobacillus sp.HTA-462的α-葡萄糖苷酶和G.stearothermophilus的外切α-1,4-糖苷酶有65%和64%的序列一致性。将基因amy112在大肠杆菌中进行诱导表达,破菌上清依次通过Ni-NTA亲和层析、脱盐、离子交换层析进行纯化,SDS-PAGE检测出现了一条64 KDa大小的蛋白带,和理论预测值一致。表征分析表明,相对于可溶性淀粉,Amy112对天然底物支链淀粉有更高的活性,其最适作用温度为40℃,最适pH为7.0,Amy112在40℃条件下孵育30min后,残余酶活维持在95%以上,在pH6.2-8.6范围内,残余酶活在60%以上。Li⁺,Ca²⁺和Mg²⁺对Amy112的活性没有显著影响,但是K⁺对Amy112的酶活有显著提高,相反一些重金属离子(Zn²⁺,Cd²⁺,Co²⁺,Hg²⁺和Cu²⁺)对Amy112酶活有显著的抑制作用。LC-MS质谱分析发现Amy112没有转糖基活性,但是HPLC分析显示Amy112能水解麦芽糖和麦芽三糖中的α-1,4-糖苷键以及异麦芽糖中的α-1,6-糖苷键,这表明Amy112兼具外切α-1,4-糖苷酶活性和寡聚-1,6-葡聚糖苷酶活性。以pNPG为底物测定该酶的动力学参数,其Km值为2.99 mM,Vmax值为66.62 mmol/min.以来源于深海地芽孢杆菌的α-葡萄糖苷酶（GSJ）的3D结构作模板（PDB编号:2ZE0）,利用Swiss-Model程序模拟Amy112的3D结构,用VMD软件分析Amy112的3D结构,分析发现Glu257同Asp200和Asp327在Amy112中构成典型的三联体催化位点（DED）。为了验证这个分析,对Amy112的推测活性位点Glu257进行定点突变,活性分析发现突变体Glu257Ala没有酶活,这表明Amy112中的257位Glu是其活性位点之一。Amy112兼具外切α-1,4-糖苷酶活性和寡聚-1,6-葡聚糖苷酶活性,在淀粉脱支过程中具有重要的应用潜力,未来我们将进一步提高该酶的活性。2、模式菌内源蛋白酶底物特异性研究重组蛋白在异源表达的过程中,经常遇到诸如表达量低或者不表达的情况,这其中很大一部分原因是因为表达宿主中的内源蛋白酶对外源表达蛋白的降解所造成。尤其是在真核生物蛋白的翻译后修饰过程中,蛋白的水解、磷酸化以及糖基化修饰会造成蛋白不正确折叠,使蛋白失活。因此,对常见表达系统的内源蛋白酶底物谱的解析非常重要,本研究选取了大肠杆菌、枯草芽孢杆菌以及巴斯德毕赤酵母等三种模式表达宿主作为研究对象,从单细胞水平上,对这三种模式菌株内源蛋白酶底物特异性进行了初步分析。通过生物信息学分析和文献检索,发现E.coli中的EspP、B.subtillis中的aprE/nprE以及GS115中的Prb1等典型的内源蛋白酶均存在特异性底物切割序列。为了筛选更多的潜在蛋白酶,我们首先利用酿酒酵母展示表达了这三种蛋白酶的底物序列,和不同的蛋白酶表型菌株的发酵上清外进行反应,然后利用流式细胞仪单双荧光检测是否切割建立筛选模型。结果显示E.coli Rosetta（DE3）菌株发酵上清可以有效切割EspP对应的底物序列,而E.coli BL21（DE3）不能有效切割EspP对应的底物序列;同时B.subtillis菌株发酵上清可以有效切割aprE/nprE对应的底物序列,GS115菌株发酵上清可以有效切割Prb1对应的底物序列。后期,我们将从整体水平的角度,构建酿酒酵母蛋白酶底物展示表达文库,绘制模式表达系统的内源蛋白酶底物图谱,从而对已知蛋白酶底物序列进行全解析和发现未知功能的新型蛋白酶。这将为外源蛋白在这些模式菌株中的高效表达提供预测。