种植修复是目前临床上最佳的缺失牙修复方式,但由于炎症、肿瘤、创伤等疾病可导致种植位点骨缺损,严重影响种植修复的效果和预后。自体骨移植等方式在很大程度上能够解决这个难题,但移植后骨吸收以及第二术区的开辟等问题仍限制了其临床使用。因此,寻求一种更佳的种植位点骨缺损修复方式是临床上亟待解决的问题。近年来,组织工程技术为骨缺损修复提供了新思路,它主要通过将种子细胞与生物材料支架构成的复合体植入骨缺损部位从而形成新生骨组织,找到最佳种子细胞是将组织工程技术应用于骨缺损修复的重要环节。脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）凭借其来源丰富、易于获取、易临床转化、具有成骨分化潜能等优势,在骨组织再生中受到广泛关注和深入研究,逐渐成为骨组织工程再生种子细胞的一种理想选择。由于ADSCs较易发生成脂向分化,因此寻找可以促进ADSCs成骨分化并抑制其成脂分化的方法,是推进ADSCs作为种子细胞应用于骨缺损修复过程中需要解决的关键问题。Exendin-4是胰高血糖素样肽-1（GLP-1）类似物艾塞那肽的主要成分,其已被证实能够通过调节Wnt信号通路促进BMSCs成骨分化,防止骨丢失和促进骨折修复。然而Exendin-4能否通过调控Wnt信号通路促进ADSCs成骨向分化,目前尚未可知。基于此,本研究将分别通过体外和体内实验,系统探讨Exendin-4对ADSCs成骨分化的影响,并对其潜在的分子机制进行研究,以寻求一种提高ADSCs成骨向分化的新方法,并为Exendin-4联合ADSCs在骨缺损修复中的推广应用奠定理论基础。本研究主要分为以下四部分:第一部分ADSCs的分离培养和鉴定及ADSCs膜片的构建和验证研究背景ADSCs凭借其来源丰富、易于获取、机体含量高、具有成骨分化潜能等优势已被广泛应用。然而,单独的ADSCs无法满足临床和基础研究应用。因此,构建高纯度的ADSCs和ADSCs膜片具有重要的应用价值,能够为其后续的体外及体内实验研究提供重要保障。研究方法使用酶消化法对小鼠脂肪组织中的ADSCs进行提取,采用CCK-8法观察ADSCs细胞的增殖情况,使用流式细胞术检测ADSCs表面标志物（CD29、CD34、CD35、和Sca-1）的表达情况,使用茜素红S染色和油红O染色对ADSCs细胞的成骨和成脂分化能力进行鉴定。此外,使用成膜诱导液对提取的ADSCs构建ADSCs膜片,并通过HE染色和透射电镜观察其成膜情况。研究结果形态学观察表明,提取的ADSCs密度均匀,形态良好;流式结果显示ADSCs阳性标志物表面抗体（CD29和Sca-1）为高表达;茜素红S染色和油红O染色显示钙化结节和脂滴明显;HE染色显示ADSCs膜片细胞含量较高,细胞之间连接较好;透射电镜显示ADSCs细胞外基质丰富,细胞器清晰可见。研究结论分离纯化的干细胞为ADSCs,具有向成骨和成脂方向分化的潜能,ADSCs膜片中的细胞功能状态良好,可为ADSCs在后续实验中的应用提供重要保障。第二部分Exendin-4对ADSCs生物学行为和功能影响的研究研究背景作为2型糖尿病的常用药物,Exendin-4已被证明对BMSCs成骨分化具有一定的促进作用,但是Exendin-4对ADSCs的生物学行为及功能的影响尚未可知,且Exendin-4是否具有促进ADSCs成骨向分化的作用,目前国内外也尚无系统的研究报道。研究方法分别使用Exendin-4和GLP-1受体拮抗剂Ex9-39对提取的ADSCs进行分组干预,并分别通过CCK-8实验、流式细胞术、Transwell侵袭实验检测Exendin-4对ADSCs细胞增殖、凋亡和迁移的影响;通过茜素红S染色和油红O染色评估Exendin-4对ADSCs成骨分化和成脂分化的作用效果;通过qRT-PCR和Western blotting实验检测Exendin-4对ADSCs骨形成相关的基因和蛋白表达水平的影响。研究结果Exendin-4对ADSCs的增殖和凋亡过程无显著影响,但显著增强了其迁移能力。Exendin-4干预后ADSCs钙化面积显著增加,脂滴数目减少;Ex9-39干预后钙化面积显著缩小,脂滴数目显著增加。Exendin-4使ADSCs的成骨相关基因和蛋白（Runx-2、ALP、COL-1、Osterix、和OPG）表达水平显著上调,而成脂相关基因和蛋白（PPAR-γ、ADPN、PLIN）表达水平显著下调;经Ex9-39处理后成骨相关基因和蛋白表达水平显著下调,而成脂相关基因和蛋白表达水平显著上调。研究结论Exendin-4能够增强ADSCs的迁移能力,显著促进ADSCs向成骨细胞方向分化,并显著抑制其向脂肪细胞方向分化。第三部分Exendin-4联合ADSCs修复骨缺损的研究研究背景细胞膜片技术为提高细胞植活率提供了科学可行的方法,然而在体内复杂的内环境和免疫系统的共同影响下,Exendin-4能否通过与ADSCs膜片联合使用,使其对ADSCs的成骨诱导分化作用更加显著,从而对骨缺损修复发挥作用,目前国内外尚未见系统的研究报道。研究方法构建股骨缺损的小鼠动物模型,对其进行Exendin-4药物注射,并于缺损处植入ADSCs膜片。通过Micro-CT扫描、HE染色和免疫组化染色观察并分析其新骨形成和骨损伤的修复情况,通过荧光双标记检测骨矿化沉积率（MAR）和骨形成率（BFR/BS）观察新骨形成量和速率,通过qRT-PCR和Western blotting实验对骨形成相关基因和蛋白表达情况进行定量分析。研究结果Micro-CT结果表明,植入ADSCs膜片后小鼠股骨较损伤组骨小梁的骨量、BV/TV和Tb.N显著增加,Exendin-4联合ADSCs进一步增加了损伤处骨小梁的骨量;HE染色、免疫组化染色以及荧光双标结果表明,ADSCs膜片以及与Exendin-4联合干预均能显著促进小鼠股骨骨小梁的骨形成,抑制体内ADSCs的成脂分化,并显著提高骨小梁的MAR和BFR/BS。此外,植入ADSCs膜片及使用Exendin-4干预后Runx-2、ALP、Osterix、COL-1和OPG的基因和蛋白表达水平增加,并且两者联合干预后表达水平进一步提高。研究结论Exendin-4与ADSCs膜片联合干预能够促进骨小梁数量增多,显著改善骨缺损造成的骨小梁微结构的衰退;并通过激活成骨相关基因和蛋白的表达水平促进其向成骨方向分化,从而发挥对骨损伤的修复作用,而两者联合使用能够对骨缺损处骨形成产生更好的作用效果。第四部分Exendin-4通过Wnt经典信号通路促进ADSCs成骨分化的机制研究研究背景Wnt/β-catenin信号通路与骨骼系统疾病的发生密切相关,Exendin-4作为治疗2型糖尿病的常用药物,能否通过Wnt/β-catenin信号通路调控ADSCs向成骨细胞方向分化,从而促进骨形成,目前国内外尚无相关研究报道。研究方法使用siRNA技术将ADSCs中的Wnt3a进行靶向沉默,随后对其施加Exendin-4干预;使用免疫荧光和Western blotting实验检测Wnt/β-catenin信号通路各蛋白的表达情况;使用CCK-8实验、流式细胞术、茜素红S染色、qRT-PCR和Western blotting实验分别对Wnt3a沉默后Exendin-4对ADSCs的细胞活性、凋亡水平、矿化能力、成骨相关基因和蛋白表达水平进行检测。研究结果Exendin-4能够上调ADSCs中Wnt3a、GSK-3β和β-catenin的蛋白表达水平;Wnt3a基因沉默后,ADSCs的细胞增殖能力显著降低,而细胞凋亡水平显著增加,且Exendin-4干预对ADSCs细胞活性无显著影响;茜素红S染色结果表明,Wnt3a沉默后Exendin-4对ADSCs的促成骨分化作用被显著抑制。此外,Wnt3a沉默后,Exendin-4干预前后ADSCs中成骨相关基因和蛋白表达水平无显著差异。研究结论Exendin-4能够激活ADSCs中Wnt/β-catenin信号通路,并通过Wnt/β-catenin信号通路调控ADSCs的成骨分化过程。本研究结果表明,Exendin-4能够显著改善ADSCs的行为功能并促进其向成骨细胞方向分化;在骨缺损修复应用中,通过显著改善骨缺损小鼠股骨的骨小梁微结构促进股骨的损伤修复。此外,本研究从分子领域揭示了Exendin-4通过Wnt/β-catenin信号通路影响ADSCs成骨分化过程的作用机制,为Exendin-4在骨损伤中的临床应用提供了科学的实验依据。