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高温会加速碱基的脱氨基速率,造成DNA中更多的损伤碱基,如果这些损伤碱基得不到及时修复就会导致基因突变,进一步引起细胞的衰老和疾病（包括癌症）的发生。次黄嘌呤（Hypoxanthine,Hx）由腺嘌呤脱氨基形成,是一种常见的损伤碱基。DNA中Hx一旦形成,在其被修复之前对其进行DNA复制,将会导致AT到GC的突变。环境中存在的烷基化物质会导致碱基烷基化,同时细胞在代谢过程中也会产生烷基化损伤,使得DNA复制和转录无法正常进行。极端嗜热古菌生长的高温环境使其基因组DNA无时无刻不在受到碱基脱氨基作用和烷基化作用所带来的威胁。为了修复这些损伤,古菌进化出由多种DNA修复酶所组成的修复系统。3-meADNA糖苷酶Ⅱ（AlkA）广泛地存在于细菌,古菌和真核生物中,能够切除DNA中的烷基化碱基和脱氨基碱基等。目前关于古菌AlkA的研究相对较少。极端嗜热耐辐射古菌Thermococcus gammatolerans分离自加利福尼亚湾的深海热液区烟囱,其最适生长温度为88℃,是目前发现的最耐受辐射的古菌,能够在5.0kGy的伽马射线下生存。T.gammatolerans的基因组测序已经完成,编码一个3-meA DNA糖苷酶Ⅱ（Tg-AlkA）。本文主要研究了 Tg-AlkA切除dsDNA中Hx和1-甲基腺嘌呤（1-methyladenine,1-meA）的生化性质及催化机理。本文的第一部分内容是关于Tg-AlkA的基因克隆、表达纯化及其生化性质的研究。首先利用分子生物学技术,克隆了 Tg-AlkA基因,然后转化至大肠杆菌表达细胞进行蛋白的诱导表达,最后通过Ni柱亲和纯化得到了 Tg-AlkA蛋白。生化数据表明,Tg-AlkA 切除 dsDNA 中的 Hx 和 1-meA 的最适温度均为 70℃,最适 pH 分别为 7.0-8.0 和5.0-7.0。Tg-AlkA的活性不依赖于二价金属离子,而Mg2+能够促进该酶的活性,其余二价金属离子在不同程度上抑制了该酶的活性。此外,Tg-AlkA切除dsDNA中的Hx和1-meA的最适NaCl浓度为0-50 mM,400 mM以上的NaCl浓度会使Tg-AlkA丧失切除活性。Tg-AlkA具有较高的耐热性,90℃热处理20min后该酶仍然保留了 71%切除dsDNA中Hx的活性和20%切除dsDNA中1-meA.的活性。底物专一性实验结果显示Tg-AlkA切除dsDNA中Hx的效率依次为Hx:T＞Hx:A≈Hx:C＞Hx:G,切除dsDNA中1-meA的效率依次为1-meA:T≈1-meA:C＞1-meA:A＞1-meA:G。动力学实验结果表明,Tg-AlkA切除dsDNA中Hx的速率为切除dsDNA中1-meA速率的2.7倍。本文的第二部分内容研究了 Tg-AlkA切除dsDNA中Hx和1-meA的催化机理。利用定点突变技术构建了 Tg-AlkA突变体:Y139A、W204A、D223A和W256A。通过诱导表达及纯化得到了上述突变体蛋白,并分析了其切除dsDNA中Hx和1-meA的能力。突变数据表明,W204A和D223A突变体对于两种底物均完全丧失了切除活性。Y139A突变体切除dsDNA中Hx的活性相比于野生型有所下降,切除dsDNA中1-meA的活性与野生型相似。W256A突变体切除dsDNA中Hx的活性与野生型相似,在100 nM和200 nM酶浓度下切除dsDNA中1-meA的活性高于野生型,在400 nM酶浓度下的活性与野生型相似。上述四个突变体结合Hx-dsDNA的活性均高于野生型,Y139A和D223A突变体结合1-meA-dsDNA的活性均低于野生型,W204A突变体结合1-meA-dsDNA的活性高于野生型,而W256A突变体结合1-meA-dsDNA的活性则与野生型相似。上述结论表明W204和D223是Tg-AlkA切除dsDNA中Hx和1-meA的关键氨基酸,而Y139和W256则可能参与了蛋白构象的维持。本文的第三部分探讨了 W204对于Tg-AlkA切除dsDNA中Hx和1-meA活性的作用。实验结果显示,即使不进行热碱处理,野生型Tg-AlkA在切除dsDNA中1-meA后依旧能使AP位点处磷酸二酯键断裂,并且其切割效率与热碱处理相似,证明了 Tg-AlkA 为一种新型的双功能 DNA 糖苷酶。而 W204A、W204E 和 W204K 突变体则完全丧失了切除活性,并且野生型和突变体蛋白在NaBH4存在下均不能与DNA产生稳定的共价中间体。上述结果表明W204是Tg-AlkA发挥活性的关键氨基酸,且该酶切除损伤碱基的分子机制可能与经典的双功能DNA糖苷酶不同。圆二色谱实验结果显示,6个突变体蛋白的二级结构相比于野生型都有不同程度的改变,其中Y139A和D223A突变体相比于野生型,二级结构发生了轻微的改变,W204K和W256A突变体相比于野生型,二级结构发生了明显的变化,而W204A和W204E的二级结构相比于野生型变化最为明显。综上,本论文通过分子生物学和生物化学技术阐明了 Tg-AlkA切除dsDNA中Hx和1-meA的生化性质和催化机理,首次发现了该酶具有双功能活性,揭示了 W204为该酶活性的关键氨基酸残基。本论文的研究成果加深了人们对3-meA DNA糖苷酶Ⅱ的理解,完善了对极端嗜热古菌基因组DNA中Hx和1-meA的修复的认知,为揭示极端嗜热古菌基因组稳定性机制提供理论依据。