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肌肉抑制素(Myostatin,MSTN)特异性表达于肌肉组织,属于TGF-β超家族,是调控肌肉生长和发育的最重要的负调控因子,并同多种疾病有关。为获得MSTN蛋白,制备多克隆抗体,深入了解MSTN基因的调控机理,将MSTN基因片段克隆入组氨酸标签融合的表达载体pET-30a-c(+)中,IPTG诱导,利用金属螯合亲和层析(MCAC)进行纯化,薄层扫描及Bradford法检测纯化蛋白的纯度与含量;免疫家兔制备多克隆抗体,利用间接ELISA法检测抗体效价,Western blotting印迹检测抗体特异性。经表达形式分析证明,融合蛋白大部分为包涵体,薄层扫描分析表明纯化蛋白纯度可达90%以上,Bradford法检测蛋白浓度约5mg/ml。抗血清效价可达1:250000以上,Westernblotting印迹检测证明抗体特异性良好。结论:经诱导表达及纯化制备出纯度较高的MSTN蛋白产物,并获得高效价特异性良好的多克隆抗体。 MSTN由骨骼肌表达进入血液以后,以自分泌或旁分泌的方式作用于骨骼肌,抑制骨骼肌的发育,而阻断MSTN作用途径可以显著增强肌肉发育。为探讨利用重组MSTN蛋白阻断体内MSTN作用途径,增强肌肉发育的可能性,本研究在体外成功表达并纯化了MSTN蛋白的基础上,将纯化后的MSTN蛋白同佐剂充分混合后,免疫雌性昆明白小鼠。第三次加强免疫后第三天同雄鼠合笼。研究结果表明,免疫后对照组和实验组母鼠体重差异不显著;在妊娠后期,两组之间体重出现差异,而分娩后,这种差异消失。仔鼠出生重在两处理组中差异极显著,实验组仔鼠出生重较对照组增加25.8%左右,但在生长阶段,两组间体重差异有逐渐减少的趋势。结论:应用重组MSTN蛋白免疫母鼠可以显著提高初生仔鼠体重。 应用重组MSTN蛋白免疫小鼠可以诱导体内免疫反应,但由于MSTN在高等动物中高度保守,而且MSTN分子量较小,因而其抗原性也相应较弱。而乙肝核心抗原是重要的载体蛋白,具有很强的免疫原性,能以T细胞依赖和T细胞非依赖作用方式产生免疫反应,并显著增强其融合蛋白的抗原性。为进一步增强MSTN的抗原性,提高疫苗的免疫效果,本研究利用PCR方法获得了MSTN羧端片段,并将其分别与乙肝核心抗原的氨端、羧端或中间融合,构建了三个重组融合表达克隆:pET-30a-c(+)-SM/HBcAg(N)、pET-30a-c(+)-SM/HBcAg(C)和pE7-30a-c(+)-SM/HBcAg(M),并经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21中实现了表达。利用金属螯合亲和层析(MCAC)进行纯化。本实验结果为进一步探讨MSTN同HBcAg的最佳融合位点,增强MSTN的免役原性奠定了基础。 MSTN对骨骼肌的分化具有重要作用,包括雄激素等多种物质可通过调节MSTN的表达而影响肌肉的发育。而甲状腺素对骨骼肌的发育也具有重要作用,为此,有必要阐明甲状腺素同MSTN的关系,为进一步提高疫苗的作用效果奠定基础。本研究以雄性成年Wistar大鼠为研究对象,探讨了不同甲状腺素水平对大鼠骨骼肌中肌肉抑制素表达的影响。方法:连续14日腹腔注射L-甲状腺素(20mg/100g体重),制备高甲大鼠模型;以0.04%甲巯咪矬连续饲喂14日,制备低甲大鼠模型;以相同数量大鼠正常饲养,作为对照组。药物处理完毕后,分别以荧光定量实时PCR和Western blotting为检测方法,检测大鼠骨骼肌中肌肉抑制素在mRNA和蛋白水平表达的变化。结果表明:在高甲状态下,大鼠骨骼肌中肌肉抑制素在mRNA和蛋白水平的表达均有显著升高;而在低甲状态下其mRNA表达水平和蛋白表达水平也有所增高,但同高甲组相比增高程度稍低。