超积累型东南景天SaARF4在根系发育和镉积累中的作用机制研究

来源 :中国林业科学研究院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:fendoudeying
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镉污染对人类健康造成严重威胁。降低植物地上部镉含量既是作物育种的重要目标,同时也是提高木本植物镉胁迫抗性的重要方式。转基因技术是实现这些目标的有效手段而筛选能够降低植物地上部镉含量的候选基因则成为实现该项技术的重要前提。本研究以镉/铅/锌超积累型东南景天(hyperaccumulating ecotype of Sedum alfredii)为材料,在全基因组水平上对生长素响应因子家族(auxin response factor,ARF)进行分析筛选候选基因,之后对候选基因的作用机理进行解析并在不同物种中进行超表达以证明其对镉积累的影响是否具有一定的保守性。为了解决操作基因组这种大数据中所遇到的诸如序列提取、批量引物等问题,开发了Sequence Processing and Data Extraction(SPDE)软件以更加便捷地分析基因家族。主要研究结果如下:1.超积累型东南景天中共含有23个ARF基因。通过系统发育分析将这23个ARF基因分为三类。与其他两类相比,位于第一类的成员其PB1蛋白结构域缺失并且这些成员的内含子数量不及其他成员的三分之一,说明这些成员可能由其他成员进化而来。染色体定位分析表明23个ARF基因分布在15条染色体上,10个ARF基因间存在共线性关系,染色体片段的复制则可能是这些成员形成的原因。比较基因组学的共线性分析表明与超积累型东南景天亲缘关系越近的物种则含有更多的ARF共线性基因。对ARF家族在镉胁迫下的表达水平进行测定,结果表明ARF基因的表达受到了镉胁迫的影响。共表达调控网络分析表明SaARF4、SaARF8.1、SaARF9.1、SaARF16.2和SaARF19.2是共表达调控网络中的HUB基因。将超积累型东南景天与其他两种景天科植物一起进行关于ARF家族的正选择与功能歧化分析,结果表明三类景天科植物共含有81个ARF基因,可以将这81个ARF基因分为四类,其中第一类的成员与其他三类成员间存在着明显的功能歧化现象并且在它们的序列中分布有大量的正选择位点。因此,第一类的ARF基因是具有进化意义的基因,超积累型东南景天中的SaARF3和SaARF4分布在第一类中。综合以上分析,筛选SaARF4进行后续的功能以及机理解析。2.将SaARF4在超积累型东南景天中进行超表达以研究其功能。结果表明超表达SaARF4能够抑制侧根以及不定根发育。并且超表达株系的导管数量、直径以及面积均显著少于野生型(wild-type plants,WT),说明SaARF4超表达可能会抑制生长素的极性运输。SaARF4组织定位分析表明SaARF4定位在维管组织且在木质部中的表达要高于在韧皮部中的表达,这一表达部位与SaARF4超表达引发导管变异的表型是相对应的。通过使用生长素运输抑制剂以及IAA,发现生长素对ARF具有正调控作用。同时,超表达SaARF4抑制了镉胁迫下乙烯的产量。通过将含有DR5启动子的GUS载体导入野生型与超表达株系,发现超表达SaARF4改变了生长素的运输。进一步对根系PIN基因表达进行测定,发现与根系生长素运输相关的PIN基因在超表达株系受到了抑制。此外,PIN基因这种被抑制的趋势与用乙烯合成抑制剂处理WT植株所表现出来的表达趋势基本一致,说明乙烯在SaARF4抑制PIN基因过程中可能发挥了媒介作用并且当用乙烯合成抑制剂处理镉胁迫下的野生型植株时,野生型植株的不定根同样会受到抑制。之后,通过ChIP-seq、酵母单杂以及双荧光素酶实验,证明SaARF4可以结合到与乙烯生物合成相关的SaACO4的启动子上并可抑制SaACO4的表达。综合以上结论,SaARF4通过抑制SaACO4的表达减少了乙烯产量从而影响了生长素的运输过程,进而对根系发育进行负调控。3.超积累东南景天的分根实验表明根系数量与地上部镉积累间存在着明显的正相关关系。在超积累型东南景天、非积累型东南景天以及南林895杨中超表达SaARF4并将这些转基因材料进行镉胁迫,发现超表达SaARF4能够有效降低转基因植株地上部镉含量。同时,对转基因杨树的叶绿素荧光参数(ΦPSII、Fv/Fm和ΦNPQ)的测定结果表明转基因杨树的受害程度要轻于野生型。综上所述,超积累型东南景天中的SaARF4是其ARF家族中具有进化意义的基因。SaARF4定位在维管组织,其过量表达会导致导管发育异常,侧根以及不定根发育的迟缓。这可能与其调控SaACO4限制乙烯产量进而影响生长素的运输相关。同时,对根系发育的抑制可能也是导致转基因株系镉含量下降的重要原因。总之,SaARF4或可作为降低植物地上部镉含量的候选基因。
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