PagCaN1的翻译后调控对维管组织分化过程中细胞程序性死亡的影响

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钙离子依赖型脱氧核糖核酸酶(CALCIUM DEPENDENT NUCLEASE 1,CAN1)作一种Ⅰ型DNA酶,可以无规则剪切单链与双链DNA。被认为在细胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)过程中发挥着剪切基因组DNA的功能。在木本模式植物杨树次生生长的木质化过程中,管状分子(tracheary element,TE)的形成被认为是经典的PCD过程,该过程受到了CAN1的影响。然而,在研究中却发现,由35S启动子驱动的组成型过表达CAN1转基因银腺杨84K(Populus alba×Populus glandulosa)仅在维管组织表型变化明显,并未出现全组织细胞程序性死亡。因此了解PagCaN1在木本植物杨树维管组织分化过成中发挥功能所受到的调控是十分重要的。本研究以PagCaN1转基因银腺杨84K为研究对象,分别对PagCaN1过表达转基因杨树与基因缺失突变体杨树,分析其PagCaN1的酶活性差异及核酸酶的组织特异性,通过PagCaN1在不同杨树材料与组织中的酶活性差异,以及原核表达体外酶活性鉴定,推断出PagCaN1在杨树茎的维管组织分化过程中受到了翻译后调控。另外还对PagCaN1亚细胞定位过程中出现的不同现象进行了深入的解析,推断出PagCaN1在进入细胞核的过程中受到了翻译后调控。另外还发现并鉴定了Pag14-3-3iota是PagCaN1的互作蛋白,能够通过与PagCaN1结合影响其进入细胞核。为揭示PagCaN1在杨树维管组织分化过程中受到的调控提供了依据。通过对PagCaN1过表达转基因杨树与基因缺失突变体杨树的酶活性鉴定,发现与野生型相比PagCaN1过表达转基因杨树的核酸酶活性增强,而基因缺失突变体杨树的核酸酶活性消失。PagCaN1在Ca2+,Mg2+条件下具有核酸酶活性。对过表达转基因材料的核酸酶活性组织特异性进行分析发现,组成型表达的转基因材料也只有在未成熟木质部有核酸酶活性。PagCaN1原核表达酶活性鉴定发现PagCaN1蛋白受到剪切。对PagCaN1蛋白的酶活性分析结果表明,PagCaN1蛋白在杨树生长发育过程中是一个在Ca2+,Mg2+条件下,在杨树未成熟木质部特异表达,受到诸多翻译后调控的核酸酶。通过比较N-GFP-PagCaN1和C-GFP-PagCaN1的亚细胞定位结果发现PagCaN1在N端融合GFP后最终定位于细胞核,而C端融合GFP后不能则进入细胞核。N-GFP-PagCaN1进入细胞核是一个缓慢的过程。而PagCaN1本身具有核定位信号,单独的核定位信号部分C端融合GFP后能够迅速的进入细胞核,C-GFP-PagCaN1和无核定位信号的C-GFP-AD均不能进入细胞核。以上结果表明,由PagCaN1本身具有进入细胞核的趋势,但是受到其它因素影响,减缓其进入细胞核的过程。继续对可能调控PagCaN1的因素进行探究,免疫共沉淀(Co-IP)质谱测序,系统发育树与表达的组织特异性分析发现Pag14-3-3iota可能是PagCaN1的互作蛋白。通过双分子荧光互补(Bi FC)证实了两者之间的互作关系和互作对亚细胞定位的影响,并且通过烟草瞬时转化实验引起的烟草叶片细胞死亡速度的差异与细胞核蛋白的蛋白质免疫印迹(Western Blot)进一步证明了Pag14-3-3iota与PagCaN1的互作,影响其进入细胞核并减缓其导致细胞程序性死亡的效率。本论文通过对Ca2+依赖型核酸酶PagCaN1在杨树维管组织分化过程中细胞程序性死亡的翻译后调控研究的阐述,为培育速生、高效的林木品种和分子育种提供理论依据。
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