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α-突触核蛋白是帕金森病相关基因PARK1/4的编码产物,也是帕金森病病理标志路易小体的主要组成部分,探讨α-突触核蛋白的具体作用机制对研究散发性帕金森病和家族遗传性帕金森病都具有重要价值。尽管α-突触核蛋白在帕金森病发病机制中的关键作用已经被研究多年,目前已知其可能通过异常聚集的寡聚体损害细胞内的生物膜系统,但其确切的致病机制仍然未明。研究显示,α-突触核蛋白异常聚集与帕金森病发病机制中的另外一个核心环节“线粒体损伤”互相关联,可作用于线粒体引起线粒体功能障碍和融合/分裂异常,因而研究α-突触核蛋白对线粒体的作用具有重要意义。葡萄糖调节蛋白75是热休克蛋白70家族的重要成员,主要定位于线粒体,被认为与帕金森病相关；也有研究称葡萄糖调节蛋白75与α-突触核蛋白存在相互作用,但就其具体作用机制未见报道。我们通过高表达致病性更强的A53T突变α-突触核蛋白、调控葡萄糖调节蛋白75的表达来研究葡萄糖调节蛋白75在A53T突变α-突触核蛋白所致线粒体损伤的作用及可能的机制。第一部分A53T突变α-突触核蛋白对SH-SY5Y细胞的影响目的探讨高表达A53T突变α-突触核蛋白对SH-SY5Y细胞的影响。方法通过脂质体转染A53T突变α-突触核蛋白构建稳定高表达A53T突变α-突触核蛋白的SH-SY5Y细胞系。在该细胞系的基础上,通过CCK-8法检测细胞在线粒体毒物鱼藤酮作用下的细胞活力变化,通过检测乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase, LDH)释放量反映鱼藤酮对细胞的损伤程度,以探讨高表达A53T突变α-突触核蛋白对多巴胺能细胞鱼藤酮敏感性的影响。通过免疫印迹检测高表达A53T突变α-突触核蛋白后细胞葡萄糖调节蛋白75的变化。通过检测线粒体膜电位、Bax/Bcl2表达量比值、细胞浆细胞色素C释放量等反映细胞线粒体功能损害。通过检测线粒体Drp1(dynamin-related protein1)和Mfn2(mitofusin-2)表达量来探讨A53T突变α-突触核蛋白影响线粒体融合/分裂的可能机制。结果A53T突变α-突触核蛋白可以加剧SH-SY5Y细胞对线粒体毒物鱼藤酮的敏感性,使鱼藤酮作用下细胞活力显著下降(p<0.01),明显增加LDH的释放(p<0.01)。同时,高表达A53T突变α-突触核蛋白后,主要定位于线粒体的葡萄糖调节蛋白75的表达量显著下降(p<0.01)。A53T突变a-突触核蛋白可以降低线粒体膜电位,使Bax/Bc12的表达比值显著升高,但并未增加细胞浆中细胞色素C的释放。我们证实A53T突变α-突触核蛋白对线粒体融合/分裂的影响并没有通过线粒体动力学相关蛋白Drpl和Mfn2。结论高表达A53T突变α-突触核蛋白能损伤SH-SY5Y细胞,该损伤作用可能是通过线粒体损伤介导实现的。第二部分葡萄糖调节蛋白75表达水平的调控及相应细胞系的构建目的调控葡萄糖调节蛋白75在细胞内的表达水平。方法根据葡萄糖调节蛋白75的基因序列设计葡萄糖调节蛋白75的干扰序列。之后在慢病毒表达质粒上加入葡萄糖调节蛋白75序列和干扰序列,利用慢病毒包装系统,成功包装并浓缩获得高浓度慢病毒颗粒。借助慢病毒转染靶细胞,经分离纯化及免疫印迹鉴定后获得能调控葡萄糖调节蛋白75表达量的稳定细胞系。结果我们成功设计了葡萄糖调节蛋白75的干扰序列,能将葡萄糖调节蛋白75的表达量下调50%以上。之后成功包装并浓缩了调控葡萄糖调节蛋白75的慢病毒颗粒,葡萄糖调节蛋白75高表达慢病毒的滴度为：1×107Tu/mL,葡萄糖调节蛋白75下调慢病毒的滴度为：3×107Tu/mL。利用慢病毒我们分离获得了能高表达葡萄糖调节蛋白75和下调葡萄糖调节蛋白75表达的细胞系。结论成功构建并分离纯化了调控葡萄糖调节蛋白75表达的细胞系。第三部分葡萄糖调节蛋白75对A53T突变α-突触核蛋白所致线粒体障碍的影响目的探讨葡萄糖调节蛋白75对A53T突变α-突触核蛋白所致线粒体障碍的影响及可能机制。方法在高表达A53T突变α-突触核蛋白的SH-SY5Y细胞中调控葡萄糖调节蛋白75表达,分别获得稳定高表达和干扰葡萄糖调节蛋白75表达的细胞系。在此基础上,检测线粒体毒物鱼藤酮诱导的细胞活力变化,探讨调控葡萄糖调节蛋白75表达对A53T突变α-突触核蛋白所致多巴胺能细胞鱼藤酮高敏感性的影响。通过检测线粒体膜电位、Bax/Bcl2表达量比值、细胞浆细胞色素C释放量等反映调控葡萄糖调节蛋白75表达对细胞线粒体功能损害的影响。通过检测线粒体Drpl和Mfn2表达量来探讨葡萄糖调节蛋白75对A53T突变α-突触核蛋白所致线粒体融合/分裂的影响及可能作用机制。结果在高表达A53T突变α-突触核蛋白的SH-SY5Y细胞中调控葡萄糖调节蛋白75表达后,细胞的LDH释放并没有显著变化；但施加鱼藤酮损伤后,下调葡萄糖调节蛋白75表达的细胞能显著改善鱼藤酮所致的细胞损害；高表达葡萄糖调节蛋白75并没有显著作用。在线粒体功能检测中我们发现,下调葡萄糖调节蛋白75表达能改善A53T突变α-突触核蛋白所致线粒体膜电位的降低,但对Bax/Bcl2表达比值及细胞色素C的释放未见显著作用。值得强调的是,调控A53T突变α-突触核蛋白对线粒体动力学相关蛋白Drpl和Mfn2在线粒体中的表达具有显著作用。高表达葡萄糖调节蛋白75能抑制线粒体Mfn2的表达,而下调葡萄糖调节蛋白75表达后,Drpl在线粒体的表达同样下降,提示葡萄糖调节蛋白75的作用可能是通过影响线粒体动力学实现的。结论下调葡萄糖调节蛋白75可以改善A53T突变α-突触核蛋白所致线粒体损伤,这种作用可能是通过影响线粒体融合/分裂而实现的。