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A型γ-氨基丁酸(aminobutyric acid,GABA)受体是哺乳动物中枢神经系统内最主要的抑制性神经递质受体,其分子结构上存在众多药物的作用位点,是目前医药和农药领域研究的热点。但因膜蛋白纯化技术及其结构解析是目前国际公认的难题,GABAA受体晶体结构领域的研究一直处于空白。本文通过分子生物学实验的手段和计算机模拟技术,我们就昆虫GABA受体的克隆及异源表达开展了研究,同时利用计算机模拟技术探测了氟虫腈对昆虫和哺乳动物的选择性机理。取得的主要成果如下:
采用分子生物学实验手段在先于全部结构解决之前优先研究了GABA受体的部分结构信息。采用RT-PCR技术扩增了果蝇GABA受体Lcch3亚基和Grd亚基的胞外区和跨膜区的序列,而Grd基因含225bp的内含子,为了对这两基因进行异源表达,利用反向PCR的方法将所获得的Grd基因的内含子进行了消除。
成功构建了Lcch3和Grd基因与表达载体pET-32a的融合基因,LCCH3基因在30℃下,1mM的IPTG诱导8h,在大肠杆菌BL21宿主菌中得到了诱导表达,通过包涌体洗涤、变性和Ni2+亲和层析纯化,稀释复性获得纯化的重组表达蛋白。应用圆二色谱测定了该诱导蛋白的二级结构,主要富含β结构。
采用Modeller软件构建了哺乳动物GABAA受体脑内主要亚型α1β2γ2五聚体通道模型。并结合本实验室以前建立的β3同源五聚体通道模型,在昆虫GABA受体组成尚未明了的情况下,以此作为昆虫GABA受体的模型,通过对接的方法,探索了氟虫腈对昆虫和哺乳动物的选择性机制,同时以GABA受体的非竞争性拈抗剂PTX作为标准。结果表明结果表明PTX与β3同源五聚体形成两条氢键,而与哺乳动物α1β2γ2五聚体形成一条氢键,而氟虫腈与β3同源五聚体形成六条氧键,而与哺乳动物α1β2γ2五聚体形成两条氢键。
本文将分子生物学实验与计算机模拟相结合,对昆虫GABA受体的部分结构及农药氟虫腈对昆虫和哺乳动物高选择性机制进行了初步研究,可望对以GABAA受体为靶标的新药的开发提供部分参考。