【摘 要】
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哺乳动物初情期是第一次发情、排卵以及获得生殖能力的关键时期。加速母畜进入初情期的时间可以提高母畜利用率,也可加速育种进程。初情期前雌激素能够通过负反馈作用抑制初情期的启动。初情期时雌激素可发挥其正反馈作用促进促性腺激素的合成与释放,以完成初情期启动。本研究利用克隆测序获取多浪羊（绵羊）GnRH、GnRHR、ERα以及ERβ基因的CDS序列,通过实时荧光定量PCR（q PCR）和培养绵羊卵巢颗粒细胞
【基金项目】
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国家自然科学基金项目“多浪羊初情期启动相关基因筛选及功能分析”（项目编号:31660652）,课题主持人:邢凤教授（塔里木大学）；
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哺乳动物初情期是第一次发情、排卵以及获得生殖能力的关键时期。加速母畜进入初情期的时间可以提高母畜利用率,也可加速育种进程。初情期前雌激素能够通过负反馈作用抑制初情期的启动。初情期时雌激素可发挥其正反馈作用促进促性腺激素的合成与释放,以完成初情期启动。本研究利用克隆测序获取多浪羊（绵羊）GnRH、GnRHR、ERα以及ERβ基因的CDS序列,通过实时荧光定量PCR（q PCR）和培养绵羊卵巢颗粒细胞试验,检测各基因在初情期前后下丘脑-垂体-性腺轴相关组织的表达以及分析外源性GnRH与雌激素在绵羊卵巢颗粒细胞中的作用,为研究绵羊初情期启动的过程中GnRH与雌激素发挥的作用提供理论补充。本试验通过克隆测序获得多浪羊的GnRH、GnRHR、ERα以及ERβ基因的CDS序列。同源性分析结果显示多浪羊GnRH、GnRHR、ERα以及ERβ基因CDS与山羊（Goat）的同源性最高;ERα与ERβ的蛋白质同源性为43.29%,C区域和E区域的同源性较高,分别为68.37%和56.35%。生物信息学分析显示多浪羊GnRHR蛋白质属于典型的G蛋白偶联受体,具有7个跨膜结构,为疏水蛋白;ERα以及ERβ蛋白质均为亲水蛋白,主要存在于细胞中,不具备跨膜结构。qPCR显示下丘脑和垂体ERαm RNA在进入初情期时明显下降,初情期后显著上升（P＜0.05）;卵巢ERβm RNA初情期时显著上升,初情期后仍然显著上升（P＜0.05）。Western blot显示ERα蛋白在下丘脑和垂体中的表达趋势与其m RNA一致。初情期时,GnRH m RNA在多浪羊下丘脑中表达量最高,显著高于初情期前后（P＜0.05）。GnRHR m RNA广泛存在于HPG轴相关组织中。垂体中GnRHR m RNA初情期时显著升高,显著高于初情期前后两个时期（P＜0.05）,与下丘脑GnRH m RNA具有相同的表达趋势。卵巢GnRH和GnRHR m RNA在初情期时显著上升,初情期后显著下降（P＜0.05）。利用外源性GnRH和雌激素刺激绵羊初情期时的卵巢颗粒细胞24 h,GnRH在500 ng/ml时能够显著抑制卵巢颗粒细胞中LH、LHR和FSHR的表达（P＜0.05）;GnRH在100 ng/ml时可上调FSH、FSHR和GnRHR,250 ng/ml时能够上调E2和ERβm RNA的表达;卵巢颗粒细胞中ERβ和GnRH m RNA随着外源雌激素浓度的的增加而增加。综上所述,在多浪羊初情期启动的过程中GnRH、GnRHR、ERα以及ERβ基因在各组织中的差异表达以及外源性GnRH和雌激素在卵巢颗粒细胞中能够调节相关激素及受体的表达,表明GnRH和雌激素以及它们的受体在绵羊初情期启动过程中发挥了关键性的作用。
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