水稻(Oryza sativa)是重要的粮食作物之一,是研究单子叶植物基因组的模式作物。水稻完备的基因组信息以及基因注释信息为顺式调控元件的研究提供了巨大的便利。真核生物中基因的表达与调控是一系列顺式作用元件与反式作用因子相互作用的结果。通过开展顺式调控元件的鉴定和功能分析,对深入理解基因表达分子调控机制具有重要意义。瞬时表达方法是指在较短的时间内将目标DNA导入到靶细胞中,实现目的DNA在细胞内短暂的高水平表达。本文通过水稻原生质体瞬时表达系统来检测顺式调控元件活性,为更好理解水稻基因调控提供实验依据。目前,对顺式调控元件研究较多的是启动子和增强子。本论文将针对启动子与增强子的快速鉴定工作开展以下三个方面的研究工作:一、水稻双向启动子瞬时表达体系的建立;二、水稻基因间区增强子瞬时表达体系的建立;三、水稻内含子增强子瞬时表达体系的建立。研究内容及结果简述如下:1.本研究依据水稻开放染色质图谱,在水稻全基因组水平上筛选双向启动子,结合组蛋白修饰数据和转录组数据定位调控共表达的双向启动子。用实验的方法将筛选到的两个组成型双向启动子BDP1、BDP2两端分别连接不同的荧光蛋白GFP和RFP,在原生质体转化后观察两侧的荧光信号来检测其活性。该方法可实现双向启动子活性的快速验证,为全基因组水平上检测双向启动子活性提供了可借鉴的方法。2.本研究基于开放染色质图谱预测水稻中增强子,从中随机挑选了 6个位点进行活性评估。根据增强子可远距离调控基因表达的特点,在启动子下游(约4.5 kb)插入增强子序列,转化后观察转化子是否有荧光,如有荧光,则说明增强子有活性。本实验能够对6个增强子活性快速评估,因此提供了一种高效鉴定水稻增强子活性的验证方法。3.本课题组前期工作中发现LOC_Os04g57220基因5’UTR区存在一段内含子序列,我们利用GFP报告基因载体,分别构建包括内含子和不包括内含子的检测载体。实验发现,只有在内含子存在时,转化子中才能观察到明显的荧光信号,证实了该内含子具有增强子活性。且当存在内含子序列时,检测到GFP表达强度提高了约2倍。通过该体系的建立,为水稻内含子增强子的快速鉴定提供了有效方法。