论文部分内容阅读
氧气缺乏会使组织代谢、形态结构和机能异常变化,面对低氧,动物生存的关键是维持机体代谢需求与能量供应的相对平衡。线粒体是细胞内的产能器官,其数量决定着细胞的能量供应,线粒体自噬与生物合成是控制线粒体数量平衡的关键。甘肃鼢鼠（Eospalax cansus）是中国特有的一种地下啮齿动物,已适应洞道低氧环境,是研究低氧耐受的极好动物模型。实验室前期研究发现,甘肃鼢鼠与SD大鼠相比,在常氧中维持着较高的骨骼肌线粒体自噬水平,低氧下线粒体数量无显著变化。那么,甘肃鼢鼠如何在低氧刺激下保持相对稳定的线粒体数量?线粒体是否在高水平自噬的同时促进自身合成?线粒体功能活性在低氧下会减弱吗?经过长时间低氧,线粒体会适应并保持健康吗?心脏作为高耗能器官,与骨骼肌的线粒体调控机制是否一致?为了回答上述问题,本研究选取甘肃鼢鼠和SD大鼠（作为对照）进行低氧耐受实验,设置常氧组（21%O2）以及6.5%O2 6h、6.5%O2 44h、10.5%O2 44h及10.5%O2 4w低氧处理组,研究不同低氧条件下,心肌与骨骼肌的线粒体数量、功能调节变化及其分子机制。观察心肌与骨骼肌的线粒体超微结构,检测线粒体DNA（mt ND1、mt Atp6）拷贝数,心肌与骨骼肌组织活性氧（ROS）水平,分析低氧下组织氧化应激强度与线粒体健康程度。使用RT-q PCR半定量线粒体自噬相关基因（Bnip3、Beclin1、Ulk1、Fundc1）及线粒体生物合成相关基因（Pgc-1a、Nrf1、Nrf2、Tfam）,Western blot技术测定线粒体自噬相关蛋白（HIF-1a,AMPK,LC3B,BNIP3,BECLIN1,ULK1,FUNDC1,LCB）与线粒体生成相关蛋白（AMPK,PGC-1a,NRF1,NRF2,TFAM）的表达水平。主要结果为:1.线粒体结构:甘肃鼢鼠心肌在常氧组未观察到明显自噬现象,6.5%O2组观察到线粒体自噬,10.5%O2 44h组线粒体融合现象增多,10.5%O2 4w组新生的小线粒体增多;甘肃鼢鼠骨骼肌在常氧组观察到线粒体自噬现象,短期（6h/44h）低氧下线粒体自噬现象增多。与SD大鼠相比,甘肃鼢鼠在6.5%O2水平下线粒体损伤程度较低,6.5%O2 6h组SD大鼠心肌线粒体空泡化程度明显高于同组甘肃鼢鼠、与6.5%O2 44h组甘肃鼢鼠损伤程度相似;6.5%O2 6h组SD大鼠骨骼肌线粒体结构模糊、嵴断裂,损伤程度明显高于6.5%O26h及6.5%O2 44h组甘肃鼢鼠。2.线粒体数量:与SD大鼠相比,甘肃鼢鼠在常氧组心肌线粒体面积小、密度大,骨骼肌线粒体面积大、密度大。与常氧组相比,6.5%O2 6h组甘肃鼢鼠心肌线粒体密度无显著变化、骨骼肌线粒体密度显著升高,SD大鼠心肌与骨骼肌线粒体密度极显著下降;6.5%O2 44h组甘肃鼢鼠心肌与骨骼肌线粒体密度显著降低;10.5%O2 44h组甘肃鼢鼠心肌线粒体密度无显著变化,骨骼肌线粒体密度显著升高,SD大鼠心肌与骨骼肌线粒体密度均显著升高;10.5%O2 4w组甘肃鼢鼠与SD大鼠心肌与骨骼肌线粒体密度均极显著升高。3.线粒体功能:甘肃鼢鼠心肌与骨骼肌mt Nd1拷贝数显著高于SD大鼠。甘肃鼢鼠与常氧组相比,心肌mt Atp6拷贝数在低氧组无显著变化,6.5%O2 44h、10.5%O24w组mt Nd1拷贝数显著升高;骨骼肌在6.5%O2 44h组mt Nd1拷贝数显著下降,10.5%O2组mt Nd1与mt Atp6拷贝数显著上升。4.组织氧化应激水平:在低氧刺激下,甘肃鼢鼠和SD大鼠心肌和骨骼肌组织ROS含量均显著升高,在10.5%O2条件下,甘肃鼢鼠心肌和骨骼肌组织ROS水平显著低于SD大鼠。5.线粒体自噬水平调节:甘肃鼢鼠心肌在常氧组,HIF-1a、BECLIN1、LCB-Ⅱ/LC3B-Ⅰ表达与SD大鼠相比无显著差异,BNIP3、ULK1表达极显著高于SD大鼠,P-AMPK、FUNDC1表达极显著低于SD大鼠。甘肃鼢鼠与常氧组相比,在6.5%O2 6h组BECLIN1、LCB-Ⅱ/LC3B-Ⅰ表达极显著上调,ULK1表达显著下调,HIF-1a、P-AMPK、BNIP3、FUNDC1表达无显著变化;6.5%O2 44h组BECLIN1、LCB-Ⅱ/LC3B-Ⅰ表达极显著上调,FUNDC1表达显著下调,HIF-1a、P-AMPK、BNIP3、ULK1表达无显著变化;10.5%O2 44h组HIF-1a、P-AMPK、BNIP3、FUNDC1表达显著上调,BECLIN1表达极显著上调,ULK1、LCB-Ⅱ/LC3B-Ⅰ表达无显著变化;10.5%O2 4w组P-AMPK极显著上调,ULK1、LCB-Ⅱ/LC3B-Ⅰ表达显著上调,FUNDC1表达显著下调,BNIP3极显著下调,HIF-1a、BECLIN1表达无显著变化。甘肃鼢鼠骨骼肌在常氧组,HIF-1a表达与SD大鼠相比无显著差异,BNIP3、ULK1、LCB-Ⅱ/LC3B-Ⅰ表达水平极显著高于SD大鼠,BECLIN1表达显著高于SD大鼠,P-AMPK、FUNDC1表达极显著低于SD大鼠。甘肃鼢鼠与常氧组相比,在6.5%O2 6h组HIF-1a、P-AMPK显著上调,BECLIN1显著下调,BNIP3极显著下调,ULK1、FUNDC1、LCB-Ⅱ/LC3B-Ⅰ表达水平无显著变化;在6.5%O2 44h组P-AMPK、LCB-Ⅱ/LC3B-Ⅰ显著上调,ULK1、BECLIN1显著下调,BNIP3极显著下调,HIF-1a、FUNDC1表达无显著变化;10.5%O2 44h组,P-AMPK、FUNDC1表达显著上调,BNIP3极显著下调,BECLIN1、LCB-Ⅱ/LC3B-Ⅰ表达显著下调,HIF-1a、ULK1表达无显著变化;10.5%O2 4w组,ULK1、FUNDC1表达显著上调,P-AMPK极显著上调,BNIP3、BECLIN1表达极显著下调,LCB-Ⅱ/LC3B-Ⅰ表达显著下调,HIF-1a表达无显著变化。6.线粒体生成调节:在转录水平,常氧及低氧组甘肃鼢鼠Nrf1、Nrf2、Tfam的m RNA表达均显著高于SD大鼠。在翻译水平,甘肃鼢鼠心肌在常氧组PGC-1a、TFAM极显著低于SD大鼠,NRF1、NRF2极显著高于SD大鼠。甘肃鼢鼠与常氧组相比,在6.5%O2 6h组NRF1显著上调,TFAM极显著上调,PGC-1a、NRF2显著下调;6.5%O2 44h组NRF1、TFAM极显著上调,NRF2显著下调,PGC-1a无显著差异;10.5%O2 44h组TFAM极显著上调,NRF2显著下调,PGC-1a、NRF1无显著差异;10.5%O2 4w组,PGC-1a、TFAM极显著上调,NRF1、NRF2无显著变化。甘肃鼢鼠骨骼肌在常氧组,PGC-1a极显著低于SD大鼠,NRF1、NRF2、TFAM与SD大鼠无显著差别。甘肃鼢鼠与常氧组相比,PGC-1a在低氧组显著上调;NRF1在6.5%O2 6h组显著上调、44h/4w组极显著上调;NRF2在短期（6h/44h）低氧下极显著上调、4w低氧后回调至与常氧组无显著差别;TFAM在6.5%O2 6h组显著上调,44h/4w低氧组极显著上调。甘肃鼢鼠心肌与骨骼肌PGC-1a与TFAM均在4w低氧组表达最高。综上,甘肃鼢鼠在10.5%O2水平下,组织氧化应激程度较低,线粒体无明显损伤,通过上调心肌线粒体自噬、下调骨骼肌线粒体自噬、增强心肌与骨骼肌线粒体生物合成来增加线粒体密度,以线粒体数量代偿应对机体缺氧;在6.5%O2水平,增强线粒体自噬的同时增强线粒体生物合成,因线粒体受损,自噬清除速率高于合成新线粒体的速率,导致线粒体数量下降,这一调节策略有利于减少ROS产生、减少能量消耗和维持细胞内氧化平衡。甘肃鼢鼠作为地下鼠在低氧下对线粒体的自噬与生物合成的调节策略使其维持着心脏与骨骼肌的高耗能活动与能量代谢平衡。