糖尿病系一种由于胰岛β细胞胰岛素分泌缺陷及(或)其生物学作用障碍引起的以高血糖为主要特征的慢性代谢性疾病。其中2型糖尿病病人约占总体糖尿病人群的90%,其发病机制非常复杂,目前已经认识到β细胞分泌功能缺陷和胰岛素抵抗是其发病机制的两个主要环节。因此,深入探索调控胰岛β细胞分泌功能新靶点及相关机制是2型糖尿病防治及药物研究亟待解决的热点问题之一。中药紫堇为粟科紫堇属植物紫堇(Corydalis edulis Maxim.)的干燥全草。《中国植物志》中描述:紫堇为一年生灰绿色草本,生长于全国多个省份,多生于海拔400-1200 m左右的丘陵、沟边或多石地。全草药用,具清热解毒,止痒,收敛,固精,润肺,止咳的功效。有关紫堇的现代化学成分或药理作用研究迄今未见报道,但近来有学者发现,紫堇在民间作为一种降血糖的饮品被百姓们广泛饮用。因此本实验对紫堇是否有明确的降血糖作用展开了探讨,并阐明其降糖作用的分子机制,为紫堇的利用及开发成为辅助治疗糖尿病的新药提供思路。本实验分为两部分:(一)采用高脂高糖饮食诱导的ApoE-/-糖尿病小鼠对紫堇提取物降血糖的作用进行药效评价。实验分为正常组、模型组、紫堇提取物低剂量组(100 mg/kg)、紫堇提取物中剂量组(200mg/kg)、紫堇提取物高剂量组(400mg/kg)和格列齐特组(100mg/kg)。给药8周后,实验对各组小鼠的空腹血糖(FBG)、血浆总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)、注射葡萄糖耐量(IPGTT)和注射胰岛素耐量(ITT)、血浆胰岛素分别进行了测定;对各组小鼠的胰腺石蜡切片进行了HE染色,观察胰腺组织形态的改变;并在实验期间隔周统计了各组小鼠的体重。结果表明,与模型组小鼠相比,紫堇提取物组小鼠的空腹血糖水平、血浆总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)的含量显著降低(P<0.05);IPGTT实验表明紫堇提取物能显著改善小鼠的葡萄糖耐量受损,同样,ITT实验表明紫堇提取物能显著增加小鼠的胰岛素敏感性;ELISA法检测结果表明紫堇提取物能显著增加小鼠血浆胰岛素含量(P<0.05),HE染色结果显示紫堇提取物对小鼠胰腺组织的形态没有影响;此外,中高剂量的紫堇提取物还能在不影响小鼠进食量的前提下增加小鼠的体重。动物实验结果说明,紫堇提取物具有降血糖的疗效,能显著改善高脂高糖饮食诱导的ApoE-/-小鼠的糖尿病症状。(二)对紫堇提取物的降糖作用的分子机制进行深入探讨。首先采用α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型对紫堇提取物进行考察,发现其不能抑制α-葡萄糖苷酶的作用。然后采用HIT-T15细胞促胰岛素分泌剂筛选模型,检测紫堇提取物对体外胰β细胞胰岛素分泌的影响。结果表明,与对照组相比,紫堇提取物呈剂量依赖性地促进胰岛素的分泌(P<0.05),且为非葡萄糖依赖性,即在无糖、低糖、高糖的条件下均可以刺激胰岛素分泌。然后实验对其促胰岛素分泌的机制进行了探究。机体正常刺激胰岛素分泌的信号通路分为激发通路和放大通路,放大通路中涉及多种激酶参与(例如蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)),实验首先对PKA通路上的相关靶点进行了研究,用EIA法检测了细胞内cAMP的含量,发现紫堇提取物组与对照组无差异(P<0.05)。然后实验对PKC这一靶点进行了研究,发现紫堇提取物与PKC的激动剂并无协同作用,但PKC的抑制剂均能不同程度地抑制紫堇提取物的促胰岛素分泌作用;然后实验采用蛋白免疫印迹法对紫堇提取物作用后各PKC亚型由胞浆到胞膜的转位情况进行了考察,发现其能促进PKCδ,ξ和μ的转位,抑制PKCδ的转位,而对PKCα,βⅡ没有作用。随后又采用免疫荧光技术、siRNA技术证实了紫堇提取物对各PKC亚型的影响。因此,紫堇提取物是通过激活nPKCs和aPKCs促进了 HIT-T15细胞胰岛素的分泌。综上所述,本实验认为紫堇提取物是通过激活nPKCs和aPKCs促进胰岛β细胞分泌胰岛素来降低高脂高糖饮食诱导的ApoE-/-小鼠的血糖,以及改善小鼠糖脂代谢相关的一系列指标,从而起到改善小鼠糖尿病的作用。实验结果提示紫堇提取物可能具有开发成为促胰岛素分泌剂新型药物的潜质。