【摘 要】
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7-脱氢胆固醇（7-dehydrocholesterol,7-DHC）是合成维生素D3的直接前体,其衍生物25-羟-VD3、1,25-二羟-VD3具有极高的药用价值。本实验室前期以酿酒酵母为底盘成功实现了7-DHC的生物合成,但仍然存在7-DHC产量过低和中间代谢产物积累较多等问题。本研究将从提高前体供应、阻断代谢支路、筛选和调控外源限速酶、调控脂质体和磷脂代谢旁路以及重构合成路径中酶的细胞器定位
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7-脱氢胆固醇（7-dehydrocholesterol,7-DHC）是合成维生素D3的直接前体,其衍生物25-羟-VD3、1,25-二羟-VD3具有极高的药用价值。本实验室前期以酿酒酵母为底盘成功实现了7-DHC的生物合成,但仍然存在7-DHC产量过低和中间代谢产物积累较多等问题。本研究将从提高前体供应、阻断代谢支路、筛选和调控外源限速酶、调控脂质体和磷脂代谢旁路以及重构合成路径中酶的细胞器定位等方面对底盘细胞和外源路径进行交替改造和优化,从而达到高产7-DHC的目的。针对7-DHC合成前体不足和DHCR24催化活性不强的问题,本研究过表达了甲羟戊酸途径中的内源基因ERG10、ERG13、t HMG1、ERG12、ERG8、ERG19、IDI1、ERG20,同时敲除旁路基因ERG5和ERG6,对底盘进行改造;筛选了11种外源酶DHCR24,发现鸡源DHCR24最优,并对其拷贝数、启动子序列、基因组整合位点和表达方式进行调整,强化合成途径。摇瓶发酵工程菌株Sy BE＿Sc0125XJ06,7-DHC产量达到169.1 mg/L,比出发菌株Sy BE＿Sc01250050（36.1 mg/L）提高了3.7倍。针对酵母内源固醇、脂质代谢对7-DHC合成途径的干扰,本研究过表达或敲除了脂代谢相关基因,发现敲除NEM1、OSH2、FLD1时7-DHC产量提升程度分别为48.9%、103.0%和20.6%。其中NEM1敲除菌株在5-L发酵罐水平的产量达到1.07 g/L,为已报道的最高产量。针对7-DHC合成路径中酶存在细胞器隔离的问题,本研究从空间上调控代谢途径中酶的细胞器定位,以平衡代谢流。将鲨烯到7-DHC路径中的酶分为ERG2-ERG3-DHCR24、ERG1-ERG11-ERG24和ERG25-ERG26-ERG27三个模块,当ERG2-ERG3-DHCR24和ERG25-ERG26-ERG27重定位于脂质体,同时过表达ERG1-ERG11-ERG24,7-DHC摇瓶水平的产量较菌株Sy BE＿Sc0125XJ06提高了92.1%,达到360.6 mg/L,为目前已报道的摇瓶水平的最高产量。本研究大幅提高了7-DHC产量,为生物合成固醇类物质提供了借鉴价值。
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