为了利用酵母菌株表达重组反刍动物胃溶菌酶,本实验以反刍动物(黄牛、牦牛、藏绵羊、藏山羊)胃溶菌酶基因为研究对象,构建并筛选了能分泌表达重组胃溶菌酶的酵母菌株,最终获得60余株重组酵母菌。发酵上清的SDS-PAGE电泳结果表明,重组反刍动物胃溶菌酶分子量为15 KDa,与理论值接近。发酵上清中重组黄牛胃溶菌酶(recombinant bovine stomach Lysozyme,rbs LYZ)和重组藏山羊胃溶菌酶(recombinant tibetan goat lysozyme,rgs LYZ)酶活性高于其他反刍动物胃溶菌酶。以重组毕赤酵母菌株(G6-1)为研究对象,研究发酵参数、基因拷贝数对重组黄牛胃溶菌酶表达的影响。(1)运用因子筛选试验(Plackett-Burman)对发酵参数进行筛选结果表明:发酵参数(装液量、诱导时间、甲醇浓度及接种量)显著影响重组黄牛溶菌酶的表达(P<0.05)。(2)进一步运用响应面法研究了装液量等发酵参数对重组黄牛胃溶菌酶活性的影响,发现当装液量:42 m L,甲醇浓度:1.1%,诱导时间:89 h时,重组黄牛胃溶菌酶的活性最高(415.2 U/m L),相较于优化前重组牛胃溶菌酶活性提高了约1.1倍。(3)运用q PCR方法研究基因拷贝数对rbs LYZ活性的影响,发现随着重组酵母菌株中bs LYZ基因拷贝数的增加,rbs LYZ的活性随之增加。(4)与阴性对照相比,重组黄牛胃溶菌酶对藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌及溶壁微球菌具有较好的抑菌作用;而对铜绿假单胞菌、蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌无抑制作用。利用解脂耶氏酵母(Polh菌株)系统重组表达牦牛胃溶菌酶。结果表明重组牦牛胃溶菌酶(recombinant yak stomach lysozyme 1a,rys LYZ1a)的分子量约为15KDa;培养72 h时rys LYZ1a表达量最高;利用CM-Sepharose FF柱层析等纯化方法获得了电泳纯级rys LYZ1a,比活性为1855.42 U/mg。在电镜下观察到rys LYZ1a通过破环金黄色葡萄球菌的细胞壁而发挥抑菌作用;rys LYZ1a能有效抵抗胃蛋白酶的降解,其在模拟猪胃液中处理4 h后仍有部分保持完整。本研究为高原反刍动物胃溶菌酶的广泛应用奠定基础。