目的通过研究TUBB4B蛋白的表达与定位以及TUBB4B与CCP1的相互作用关系,探究二者在pcd^3J（-/-）小鼠不育中的分子机制。方法1.采用q PCR、Western blot方法分别在基因水平和蛋白水平检测了TUBB4B在pcd^3J（+/+）小鼠各组织的表达情况。2.采用免疫荧光实验检测了TUBB4B在pcd^3J（+/+）小鼠精子中的表达情况。3.采用免疫组化实验方法检测TUBB4B在pcd^3J（+/+）小鼠睾丸、pcd^3J（-/-）小鼠睾丸中的表达情况。4.通过PCR方法检测了Tubb4b在小鼠睾丸支持细胞（15P-1细胞）、小鼠睾丸间质细胞（TM3细胞）、小鼠B型精原细胞（GC1细胞）中的表达情况。5.通过Western blot检测了TUBB4B在出生后P15、P18、P30、P35的pcd^3J（-/-）小鼠和野生型Balb/c小鼠睾丸中的表达情况。6.通过Western blot检测CCP1蛋白对微管蛋白的聚谷氨酰胺化（poly E）水平的改变。7.免疫组化实验方法检测了β-Tubulin和β-Actin蛋白在pcd^3J（-/-）突变小鼠和野生型小鼠睾丸中表达的差异。8.采用q PCR和Western blot方法分别在基因水平和蛋白水平检测了TUBB4B在敲减了CCP1基因的GC1细胞的表达。9.通过i TRAQ LC-MS/MS对敲减了CCP1基因的GC1细胞中表达水平改变的蛋白质进行了分析。结果1.q PCR实验结果显示Tubb4b基因在野生型Balb/c小鼠多数组织广泛表达,尤其在睾丸中高表达,Western blot实验结果显示TUBB4B蛋白在小鼠睾丸中高表达。2.通过免疫荧光染色发现TUBB4B在成年野生型Balb/c小鼠输精管和附睾的精子头部和尾部都表达,特别是精子的头部和尾部中段的线粒体鞘部位表达明显。3.免疫组化结果显示TUBB4B在pcd^3J（-/-）小鼠和野生型对照小鼠睾丸的支持细胞和生精细胞中均表达。通过q PCR和Western blot检测TUBB4B在小鼠TM3间质细胞、15P-1支持细胞和GC-1精原细胞中的表达发现其在三种细胞系中的表达情况与在小鼠睾丸中的表达结果一致。4.TUBB4B在野生型Balb/c小鼠睾丸中的表达随着年龄的增长而逐渐增加,但在pcd^3J（-/-）小鼠中,TUBB4B的表达在P18的时候降低,到P30时候表达升高。与野生型小鼠相比,TUBB4B在pcd^3J（-/-）小鼠睾丸中的表达从P18开始下调。5.Western blot实验结果显示转染了p EGFP-CCP1表达质粒的HEK293T细胞中TUBB4B表达水平上调,蛋白的poly E水平下调。同样,转染了p EGFP-CCP1和p-Myc-DDK-Tubb4b表达质粒的HEK293T细胞中可见蛋白的poly E水平降低。6.通过检测细胞骨架蛋白β-Tubulin和β-Actin在pcd^3J（-/-）小鼠睾丸中的表达发现,pcd^3J（-/-）小鼠睾丸中生精细胞的形态异常。7.TUBB4B在敲减了CCP1基因的GC1细胞中表达没有显著变化。8.i TRAQ定量蛋白质组分析显示59种蛋白的表达水平在敲减了CCP1基因的GC1细胞中发生了变化,其中PFN1蛋白和CORO2B蛋白与微管和肌动蛋白有关。结论1.TUBB4B在小鼠的睾丸组织和附睾精子中都表达。2.从pcd^3J（-/-）小鼠出生后P18（晚期粗线期精母细胞阶段）开始,TUBB4B表达异常降低,可能与pcd^3J（-/-）小鼠睾丸生殖细胞减少有关。3.CCP1蛋白对TUBB4B具有去多聚谷氨酰胺化作用。4.pcd^3J（-/-）小鼠睾丸组织中细胞骨架结构异常。5.在敲减了CCP1基因的GC1精原细胞中表达上调的PFN1和下调的CORO2B蛋白均与微管和肌动蛋白相关,可能参与睾丸细胞形态的维持。具体作用机制有待进一步研究。