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目的利用Cre/LoxP系统繁殖ERN1(endoplasmic reticulum to nucleus signaling 1)软骨组织特异性基因敲除小鼠,观察并分析小鼠不同时间点生长发育表型及特征,进一步明确ERN1基因与软骨生长发育的关系,初步探讨ERN1调控小鼠软骨生长发育的机制,有助于解析ERN1与软骨发育新的调控机制、为后续开发参与软骨生成与修复的生物制剂提供实验基础。方法利用Cre/LoxP系统,先将去Neo且去Flp的flox阳性杂合子小鼠(ERN1flox/+)与Col2-Cre小鼠交配,获得flox阳性且Col2-Cre阳性小鼠(Col2-Cre;ERN1flox/+)以及flox阳性且Col2-Cre阴性小鼠(ERN1flox/+),再将Col2-Cre;ERN1flox/+小鼠自交或与ERN1flox/+小鼠交配,并对其基因型进行鉴定,提取同窝实验组小鼠(ERN1 CKO)和对照组小鼠(ERN1flox/flox)的软骨及其他组织,运用PCR和Western blot验证是否成功获得ERN1基因条件性基因敲除小鼠模型(Col2-Cre;ERN1flox/flox,ERN1 CKO)。通过对不同时期的实验小鼠和对照小鼠进行体长、股骨长度测量并制作石蜡切片进行HE染色(hematoxylin-eosin staining)和番红快绿染色(SafraninO-Fast Green staining),观察小鼠生长板发育表型;Western blot、RT-PCR检测原代软骨细胞和软骨组织中软骨发育相关标志基因表达,免疫组化(immunohistochemistry,IHC)验证小鼠生长板肥大软骨细胞标志基因的表达;包装ERN1及其不同结构域腺病毒;RT-PCR检测ERN1调控软骨细胞分化的作用;Western blot检测原代软骨细胞与C28I2细胞中内质网应激相关标志基因的表达;在C28I2过表达和敲低ERN1通过免疫荧光检测ERN1与自噬的关系;运用免疫共沉淀结合质谱分析层析柱蛋白富集率筛选软骨细胞中ERN1结合蛋白;应用LIC方法构建CHERP重组质粒,并通过免疫共沉淀验证ERN1与CHERP相互结合作用;通过过表达和siERN1,明确ERN1和CHERP及两者结合调控自噬的关系。结果基因组PCR和Western blot结果说明ERN1 CKO小鼠在软骨组织中敲除ERN1,其他组织中均能正常表达ERN1,证明ERN1软骨组织条件性基因敲除小鼠模型成功获得。4、8、12周,ERN1 CKO小鼠的体长与股骨长度均长于对照鼠(P<0.05);HE和番红快绿染色显示,两种小鼠在胚胎时期(E15、E17、E19)软骨生长板结构正常,4、8周ERN1 CKO小鼠胫骨生长板总长度、肥大区长度及肥大区占比均高于对照鼠;原代软骨细胞mRNA水平、软骨组织蛋白水平结果提示ERN1 CKO小鼠肥大软骨细胞标志基因COL10A1和MMP13的表达上调,此外IHC提示COL2A1、Aggrecan、Ki67表达低于对照鼠。成功包装ERN1及其不同结构域腺病毒,过表达ERN1重组腺病毒抑制软骨细胞分化;TM可诱导C28I2人软骨细胞和正常小鼠原代软骨细胞产生内质网应激,而在ERN1-/-原代软骨细胞中无法激活ER stress;C28I2细胞中过表达ERN1重组质粒可促进自噬,敲低ERN1则抑制自噬;免疫共沉淀结合质谱分析层析柱蛋白富集率筛选获得ERN1结合蛋白内质网钙离子稳态蛋白(CHERP);成功构建CHERP真核表达质粒并确定ERN1与CHERP存在相互作用;明确ERN1与CHERP调控关系及两者结合对自噬的影响。结论(1)应用Cre/Loxp系统成功获得ERN1软骨组织特异性基因敲除小鼠,小鼠表型分析显示ERN1特异性软骨敲除后导致小鼠软骨生长发育异常;(2)体外实验证明过表达ERN1抑制软骨细胞分化、促进自噬;ERN1缺陷则不能正常激活ER Stress和自噬;(3)ERN1通过与CHERP相互结合,参与自噬小泡和溶酶体的融合进而调控自噬性溶酶体的产生,通过调控ER Stress和自噬的激活参与软骨细胞分化和软骨发育。