CRISPR/Cas9是划时代的第三代基因编辑技术。IGF2基因编码胰岛素样生长因子2(Insulin-like growth factor 2,IGF2),该生长因子是一种促进细胞分裂的多肽,参与生长发育,影响骨骼肌质量和脂肪沉积。IGF2基因具有高度的保守性,其内含子3上的阻遏物锌指蛋白6(Zinc finger bed domain containing,ZBED6)结合位点被破坏,会引起骨骼肌中IGF2的表达量上调,进而影响肌肉生长和脂肪沉积。西门塔尔为肉、乳兼用型牛种,它的产肉性能及泌乳性能与纯种奶牛相当。IGF2基因第三内含子ZBED6结合位点敲除对IGF2表达量影响的相关研究多集中于小鼠和猪,牛上鲜有报道,需要开展相关研究,故此,本研究拟用CRISPR/Cas9技术对牛IGF2基因进行编辑并制备基因编辑胚胎,以期探究牛IGF2基因第三内含子ZBED6结合位点敲除IGF2表达量变化情况,为生产高产肉牛奠定理论基础和制备肉牛育种新材料。本研究主要结果如下:1.利用CRISPR Design软件对牛IGF2第三内含子中抑制因子ZBED6结合位点及其附近序列设计5个单一导向RNA(Single-guide RNA,sg RNA)并成功构建对应的PX458-sg RNA基因打靶载体。随后,在细胞水平借助T7E1酶切结合T-A克隆检测的方法验证编辑效率,其中sg RNA1效率最高,约为40%。2.通过流式细胞分选结合无限稀释手段,成功获得10株西门塔尔IGF2中ZBED6结合位点完全敲除的细胞系,其中1株为纯合突变。3.在小鼠C2C12细胞中利用荧光素酶试验和荧光定量PCR在牛成纤维细胞上分析突变对IGF2表达的影响,结果显示IGF2非编码区突变可增强IGF2启动子3活性,在转录水平提高IGF2表达。4.运用体细胞核移植技术获得34枚42号纯合突变细胞系克隆胚胎并利用T-A克隆检测了9枚克隆胚胎ZBED6结合位点敲除情况,结果获得100%的敲除效率。随后,经PCR鉴定,42号细胞系及其制备的克隆胚胎均无载体骨架残留,无外源基因引入,具生物安全性,可用于胚胎移植。综上所述,本试验构建的CRISPR/Cas9系统可有效编辑牛肌肉生长相关基因IGF2并提高其表达水平,此外,本试验还借助体细胞核移植技术获得了可用于胚胎移植的牛IGF2基因编辑胚胎。本试验结果为高产肉牛的分子育种奠定了基础。