高同型半胱氨酸加重自发性高血压大鼠动脉损害的机制研究研究背景流行病学研究发现,高血压合并高同型半胱氨酸血症（HHcy）（简称H型高血压）在我国高发,约占高血压患者总数的75%。并且,H型高血压患者心脑血管事件发生率远高于非HHcy高血压患者。HHcy被定义为同型半胱氨酸（Hcy）水平超过15μmol/L,被公认为21世纪的“新胆固醇”,是心脑血管疾病的独立危险因素。然而,HHcy促使高血压患者心脑血管疾病高发机制仍众说纷纭,且临床多采用B族维生素治疗,其能否完全规避HHcy的不良影响还不十分清楚。由此,本研究根植于临床,具有现实意义和临床应用价值。为全面系统掌握HHcy致病机制,尤其是HHcy诱导加重高血压动脉损害机制,我们检索近5年发表在Pubmed上的相关文献,归纳HHcy致病机制大致为:内皮细胞毒性、血管重塑、高氧化应激、免疫炎症过反应、脂代谢紊乱、甲基化修饰异常、转硫代谢受阻等方面。同时借助生物网络学分析HHcy协同高血压致动脉损害的分子基础,筛查出HHcy致病的主要分子通路——氧化应激通路和免疫炎症通路,作为本课题的主导研究方向。氧化应激通路中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶（Nox）,是第一个被发现可以产生活性氧（ROS）的酶,也是机体氧化应激整合反应中的重要分子。Nox家族中的Nox1、Nox2、Nox4和Nox5亚型在血管组织均有表达,其中Nox4多表达于血管内皮细胞。另外,作为经典炎症通路的核因子κB（NF-κB）是一个转录因子大家族,广泛参与细胞功能和信号调控,在免疫应答、炎症反应中发挥关键性作用。如NF-κB的激活可以诱导产生肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等,并影响血管粘附蛋白-1（VAP-1）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）等。研究发现,HHcy可通过Nox4和IL-6促使氧化应激和免疫炎症对血管内皮细胞的损伤,然而HHcy协同高血压致动脉血管损害的超高发生率,仍需广角度全方位加以研究和预防。故此,我们模拟H型高血压构建实验室大鼠模型,探究HHcy加重高血压动脉损害的关键性分子通路,为临床有效防治H型高血压心脑血管并发症提供理论依据和可行方案。研究目的1.验证高血压大鼠腹腔注射DL-Hcy构建H型高血压大鼠模型的可行性。2.论证H型高血压动脉损伤与氧化应激和免疫炎症的关系。3.探索HHcy加重高血压动脉损伤或重塑的致病机制和关键性分子通路。研究方法1.动物模型构建与分组健康SPF级Wistar-Kyoto大鼠（WKY）随机分为WKY组、HHcy组,自发性高血压大鼠（SHR）随机分为SHR组、SHR+HHcy组,每组8只。其中,WKY组和SHR组大鼠腹腔注射生理盐水（PS,5ml/kg,每日2次）,连续12周;HHcy组及SHR+HHcy组大鼠腹腔注射2%DL-Hcy（5ml/kg,每日2次）,连续12周。2.基础数据与生化指标检测无创大鼠尾动脉血压仪测量大鼠尾动脉收缩压（SBP）和舒张压（DBP）。Agilent 1100液相色谱仪测定血浆Hcy浓度。羟胺法和硫代巴比妥酸法分别检测大鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）。3.组织病理学分析大鼠主动脉和颈动脉组织切片行苏木精-伊红染色（HE）和马松三色染色（masson）。应用Image-Pro Plus 6.0软件计数相同视野内（HE染色切片）平滑肌细胞核数量,作为动脉平滑肌细胞增生肥大定量分析的结果;计算相同视野内（masson染色切片）蓝染胶原与主动脉固定区域的比值,作为动脉组织内胶原沉积半定量分析的结果。4.免疫组化分析采用免疫组化平均光密度值（AO值）分析法检测VAP-1在大鼠动脉组织中表达量。应用Image-Pro Plus 6.0软件选取相同的棕黄色作为判断所有照片阳性的统一标准,获取每张照片阳性累积光密度值（IOD）以及组织的像素面积（AREA）,求出平均光密度值 AO=IOD/AREA。采用免疫荧光计数法检测每张动脉切片随机视野内巨噬细胞标志分子CD68浸润表达量。应用Image-Pro Plus 6.0软件计数随机视野内CD68阳性细胞数。5.实时荧光定量PCR检测目的基因mRNA水平Trizol试剂提取大鼠动脉组织的总RNA,逆转录成cDNA,使用TB Green Premix Ex Taq（Takara,RR820A）和目的基因的引物序列进行qRT-PCR,GAPDH作为管家基因平衡目的基因mRNA的相对表达水平。根据周期阈值（2-△△ct）法计算目的基因mRNA的相对表达量。6.蛋白质免疫印迹分析蛋白提取试剂盒（Protein Extraction Kit,SA-03-BV）提取动脉组织总蛋白。SDS-PAGE电泳分离蛋白样品,湿转法将蛋白转移到硝酸纤维素膜上,牛奶封闭后,特异性一抗4℃孵育过夜,然后二抗室温孵育1小时。ECL化学发光液激发蛋白条带显影,Image Lab软件量化蛋白条带灰度,计算目的蛋白相对于GAPDH的相对表达量。7.统计学分析采用两独立样本t检验对3个病理组（HHcy组、SHR组、SHR+HHcy组）分别与对照组（WKY组）进行组间差异性分析,结果以均数±标准差表示。所有统计分析采用SPSS 13.0版本软件进行,P＜0.05为差异有统计学意义。研究结果1.腹腔注射DL-Hcy成功构建HHcy模型大鼠造模组大鼠经持续腹腔注射DL-Hcy共12周后,血浆Hcy水平均大于15μmol/L,达到HHcy模型构建标准,其中SHR血压均高于200/140mmHg,故H型高血压大鼠模型构建成功。2.HHcy诱导氧化应激水平升高血清中氧化应激产物MDA的升高,抗氧化应激分子SOD的降低,均表示高氧化应激水平。我们的结果显示:H型高血压组大鼠MDA水平最高,SOD水平最低,即H型高血压大鼠体内氧化应激水平最高,其次为高血压大鼠和HHcy大鼠。提示高氧化应激因素参与了 H型高血压动脉损害机制,且HHcy促进了氧化应激反应。3.HHcy促进高血压动脉重塑大鼠动脉组织HE染色示:H型高血压组大鼠血管平滑肌细胞增生最为显著,高血压组、HHcy组依次次之。大鼠动脉组织masson染色示:H型高血压组胶原蛋白沉积量显著增加,高血压组、HHcy组依次次之。4.HHcy促进动脉组织炎症反应免疫组化分析显示:VAP-1吸光值在H型高血压组高表达,然后依次为SHR组和HHcy组。提示HHcy促进了动脉组织细胞炎症吸附因子的分泌,并且联合高血压后显著促进其表达。免疫荧光计数检测:H型高血压组大鼠动脉组织中CD68分子浸润最为明显。即,HHcy联合高血压后显著促进单核巨噬细胞动脉组织浸润。5.HHcy促进TGF-β表达血管重塑重要调控因子TGF-β的mRNA及蛋白表达水平在HHcy组、SHR组、SHR+HHcy组大鼠动脉组织中呈渐进式增高,提示HHcy促进H型高血压大鼠动脉组织中TGF-β的过表达。6.HHcy显著促进IL-6表达免疫/炎症通路分子IL-6、TNF-α、NF-κB P65、Akt1在H型高血压组均显著增高,其中,IL-6在HHcy组也显著高表达,提示HHcy具有明显的致炎性,可能通过Akt1/NF-κB P65/IL-6炎症通路加重H型高血压大鼠的动脉损伤。7.HHcy促进Nox表达H型高血压大鼠动脉组织中,氧化应激分子Nox2、Nox4的mRNA转录水平和蛋白表达水平均明显上升。此外,Nox2和Nox4的表达量在HHcy组也较明显升高,提示HHcy可通过Nox氧化应激分子通路加重H型高血压大鼠的动脉损伤。结论1.SHR腹腔注射DL-Hcy模型可用于模拟H型高血压动脉损害的机制研究。2.H型高血压动脉病理改变与氧化应激高反应、炎症因子组织过浸润均有关。3.HHcy可通过Akt1/NF-κB P65/IL-6通路,加重H型高血压动脉血管的炎性损害。4.HHcy可通过Nox2、Nox4/ROS通路,加重H型高血压动脉血管的氧化应激损害。5.HHcy通过氧化应激和免疫炎症双通路促使TGF-β过表达,加重H型高血压大鼠动脉重塑。6.HHcy显著的致炎特性,可能是H型高血压动脉高损害率的主导因素。叶酸对高同型半胱氨酸血症高血压大鼠动脉血管保护机制研究研究背景H型高血压在我国的高发病率与我国人群HHcy水平有关,而HHcy又与叶酸代谢及摄入量的异常密切相关。随着我国人口老龄化的增长,叶酸等B族维生素在体内的流失速度也增快,预计H型高血压发病率在我国也将居高不下。研究发现,缺少叶酸等B族维生素复合体的高蛋氨酸饮食会对心血管系统产生深远的负面影响,而补充叶酸可降低21%首发脑卒中风险,和20%心血管事件风险。可见,适量摄入叶酸,补充体内叶酸水平,对H型高血压心脑血管疾病的防治意义重大。叶酸是一种B族维生素,是人体健康所必需的无数代谢和生物过程的营养素,是数百种代谢酶的辅助因子,还是体内强有力的生物抗氧化剂。Vera Gorelova等提出叶酸有助于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的产生,维持细胞还原能力对抗氧化应激损伤。而Cheng Fei等发现叶酸可抑制NADPH氧化酶（Nox）,从而减轻活性氧（ROS）引起的血管内皮细胞损伤,可见叶酸与NADPH/Nox动态平衡有关。另外,核因子E2相关因子2（Nrf-2）是细胞重要的内生性抗氧化因子,可促进下游超氧化物歧化酶（SOD）等还原分子的生成。然而,叶酸对抗H型高血压动脉损害与Nox/ROS通路及Nrf-2/SOD通路的双向研究,少见报导。研究发现活化的巨噬细胞高表达叶酸受体,并有文章提出叶酸等B族维生素降低了免疫炎症标志物。已知NF-κB家族是研究最多最经典的免疫炎症调控分子之一,它的活化可以促进下游炎性因子,如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）等的分泌。而血管粘附蛋白-1（VAP-1）、巨噬细胞趋化蛋白-1（MCP-1）是一种促炎趋化因子,可吸附中性粒细胞、巨噬细胞等免疫炎症细胞致组织浸润和炎性反应。研究发现心脑血管病变严重程度与局部炎症反应呈正相关,而叶酸干预H型高血压,能否减轻其动脉炎性损害及免疫炎症细胞的组织浸润,尚不十分清晰。肾素血管紧张素醛固酮系统（RAAS）特别是动脉组织内独立存在的RAAS,在心脑血管生理稳态以及病理进展中发挥着重要作用。研究发现,血管紧张素受体（ATR）、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）在动脉组织中高表达,其中AngⅡ是循环RAAS中的1000倍,它可通过多种途径引起动脉血管强烈收缩。有学者提出,过表达的AngⅡ还可通过HHcy、氧化应激、免疫炎症等机制损伤血管结构,诱导动脉重塑;AngⅡ也可诱导内皮型一氧化氮合酶（eNOS）解耦联、致一氧化氮（NO）氧化失活,扰乱血管功能;而补充叶酸可缓解上述不良反应。然而,叶酸是否能直接影响H型高血压动脉组织中RAAS的表达量,不详且机制不明。在我国,叶酸已作为H型高血压患者的联合用药之一。我们前期实验已证实叶酸可以显著降低HHcy浓度,然而叶酸对H型高血压动脉血管的其它有益作用及保护机制尚不十分清楚,特别是叶酸与免疫/炎症反应,叶酸与动脉局部RAAS变化的研究相对少见。因此我们设计H型高血压大鼠叶酸灌胃模型,探讨叶酸与动脉组织中氧化应激通路、免疫炎症反应、局部RAAS活性的潜在关系,为临床防治H型高血压动脉损害提供理论依据和可行性治疗方案。研究目的1.构建H型高血压大鼠模型和叶酸灌胃模型,用于模拟叶酸对抗H型高血压动脉损害的研究。2.研究叶酸与氧化应激Nox/ROS通路分子,以及与抗氧化应激Nrf-2/SOD通路分子的关系,探讨叶酸抗氧化应激机制。3.研究叶酸与NF-κB/TNF-α or IL-6通路分子的关系,探讨叶酸潜在的抗炎机制。4.观察叶酸干预后动脉组织中RAAS分子表达量的变化,探讨叶酸与血管局部RAAS活性的潜在关系。研究方法1.动物模型构建与分组自发性高血压大鼠（SHR）随机分为对照组、HHcy组和HHcy+叶酸（FA）组,每组8只。对照组给予腹腔注射生理盐水（PS,5ml/kg,每日2次）,连续12周;HHcy组及HHcy+FA组作为H型高血压模型构建组,予腹腔注射2%DL-Hcy（5ml/kg,每日2次）,连续12周。其中HHcy+FA组于实验的后8周给予叶酸（4mg/kg/d）灌胃模拟叶酸治疗模型,另外2组（对照组和HHcy组）分别给予PS（0.5ml/d）灌胃作为非叶酸治疗对照组。2.基础数据与生化指标检测无创大鼠尾动脉血压仪测量大鼠尾动脉收缩压（SBP）和舒张压（DBP）。Agilent 1100液相色谱仪测定血浆Hey浓度。羟胺法和硫代巴比妥酸法分别检测大鼠血清SOD和脂质过氧化产物丙二醛（MDA）。3.组织病理学分析大鼠主动脉和颈动脉组织切片行苏木精-伊红染色（HE）和马松三色染色（masson）,比较三组动脉内膜—中膜厚度（IMT）,观察动脉平滑肌增生肥大、胶原蛋白沉积情况。4.免疫组化分析免疫组化染色检测VAP-1在动脉组织中表达量。应用Image-Pro Plus 6.0软件选取相同的棕黄色作为判断所有照片阳性的统一标准,分析得出每张照片阳性累积光密度值（IOD）以及组织的像素面积（AREA）,求出平均光密度值（AO值）=IOD/AREA。5.实时荧光定量PCR检测目的基因mRNA水平Trizol试剂提取大鼠动脉组织的总RNA,逆转录成cDNA,使用TB Green Premix Ex Taq（Takara,RR820A）和目的基因的引物序列进行qRT-PCR,GAPDH作为管家基因平衡目的基因mRNA的相对表达水平。根据周期阈值（2-△△Ct）法计算目的基因mRNA的相对表达量。6.蛋白质免疫印迹分析蛋白提取试剂盒（Protein Extraction Kit,SA-03-BV）提取动脉组织总蛋白。SDS-PAGE电泳分离蛋白样品,湿转法将蛋白转移到硝酸纤维素膜上,5%牛奶封闭后,特异性一抗4℃孵育过夜,然后二抗室温孵育2小时。ECL化学发光液激发蛋白条带显影,Image Lab软件量化蛋白条带灰度,并计算目的蛋白相对于GAPDH的相对表达量。7.酶联免疫吸附试验（ELISA）取各组动脉组织相同浓度的蛋白匀浆上清液,ELISA检测各组IL-6的表达。所有检测均按照ELISA试剂盒（Elabscience,E-EL-R0015C）说明进行。每组实验至少重复三次。用酶标仪在450nm波长下测定各组的OD值,根据标准样品OD值和浓度计算各组IL-6因子的相对浓度。8.统计学分析采用单因素方差分析进行统计学分析,然后进行LSD检验。结果以均数±标准差表示。所有统计分析均采用SPSS 13.0版本软件进行,P＜0.05为差异有统计学意义。研究结果1.叶酸显著降低HHcy,但非完全抵消其水平HHcy+FA组Hcy浓度较HHcy组显著降低,提示叶酸显著降低了 H型高血压大鼠的HHcy水平;但是HHcy+FA组Hcy浓度仍明显高于对照组,提示叶酸未能完全对抗或消除H型高血压的HHcy浓度,不能使其恢复到DL-Hcy造模前水平。2.叶酸显著降低循环中氧化应激水平叶酸明显降低H型高血压大鼠的MDA水平,同时显著升高SOD水平,且HHcy+FA组大鼠血清SOD水平甚至高于对照组,提示叶酸显著的抗氧化应激能力可能更多的体现在促进还原分子或抗氧化应激产物的生成上。3.叶酸抑制动脉组织中促炎因子VAP-1的表达VAP-1表达量在H型高血压大鼠动脉组织中显著增加,而叶酸干预后可明显降低其动脉组织表达量（P＜0.05）。3.叶酸抑制动脉组织NF-κB P65/IL-6通路分子的表达HHcy+FA组与H型高血压组相比,其动脉组织中免疫炎症通路分子NF-κB P65和IL-6的相对表达量均显著下降,相反H型高血压组大鼠较对照组却明显增高。提示HHcy促进了动脉组织的炎症反应,而叶酸恰恰抑制了其炎症反应,且叶酸的抗炎潜质逆平行于HHcy的致炎特性。4.叶酸抑制动脉组织Nox2的表达与H型高血压组相比,HHcy+FA组大鼠动脉组织中氧化应激分子Nox2的mRNA转录水平和蛋白相对表达量均明显下降。相反,H型高血压组大鼠较对照组却呈显著升高趋势。提示叶酸要么直接抑制Nox2,或么通过对抗HHcy间接降低了 Nox2分子表达。5.叶酸促进动脉组织Nrf-2的表达HHcy+FA组较HHcy组,大鼠动脉组织中抗氧化应激分子Nrf-2的mRNA转录水平和蛋白相对表达量均显著升高,而HHcy组较对照组呈明显下降趋势。提示叶酸能明显促进Nrf-2分子通路,以提高还原分子产物、显著降低氧化应激水平。6.叶酸促进动脉组织eNOS的表达与HHcy组相比,HHcy+FA组大鼠动脉组织中eNOS的mRNA转录水平显著升高。相反,H型高血压组大鼠较对照组呈明显下降趋势。提示叶酸可保护H型高血压大鼠eNOS/NO分子通路以改善动脉血管功能。7.叶酸伴发动脉组织RAAS改变动脉组织中AngⅡ、ATR的表达量,在HHcy+FA组明显下调,而ACE2在HHcy+FA组却明显上调。提示叶酸干预后,伴发了动脉组织局部RAAS的有益改变。结论1.叶酸防治H型高血压动脉损伤,从多途径显示出有益作用。2.叶酸降低H型高血压的HHcy水平,减轻HHcy对动脉组织的不良影响。3.叶酸抑制NF-κB P65/IL-6通路分子过表达,具有潜在的抗炎特性。4.叶酸抑制Nox2/MDA通路分子,促进Nrf-2/SOD通路分子,具有明显的抗氧化应激能力。5.叶酸防止eNOS/NO通路分子被氧化,具有血管功能保护作用。6.叶酸干预H型高血压,伴随动脉组织中局部RAAS活性的有利改变。