论文部分内容阅读
第一部分人血浆乳酸水平与冠状动脉钙化相关研究目的:研究人血浆乳酸水平与冠状动脉钙化积分（Agatston评分）的相关性。方法:共纳入300例2018年11月至2020年5月期间在东南大学附属中大医院或江苏大学附属医院就诊的患有心绞痛或可疑冠心病的患者。经排除标准排除后,最终纳入274例患者。通过冠状动脉断层扫描计算Agatston评分。采集入选患者空腹外周血,通过ELISA法检测血浆乳酸、CML及MGP水平。结果:（1）人血浆乳酸与CML水平随着Agatston评分的增高而升高,MGP水平则相反。（2）多元线性回归模型提示人血浆乳酸水平与Agatston评分独立正相关,多元Logistic回归模型显示高乳酸水平可以预测冠状动脉钙化（Coronary artery calcification,CAC）的存在。（3）CAC患者血浆乳酸水平与MGP和CML水平相关。ROC曲线分析提示,人血浆乳酸水平（＞1.47 mmol/L）对CAC有较高的临床诊断准确性,与MGP联合分析可进一步提高诊断准确性。结论:人血浆乳酸水平是预测和诊断CAC的生物标志物。第二部分乳酸调控线粒体分裂与自噬促进大鼠胸主动脉钙化的作用机制目的:研究外源性乳酸对大鼠胸主动脉钙化的作用及机制。方法:以正常或2型糖尿病SD大鼠（高脂喂养,链脲霉素腹腔注射）为背景,利用维生素D3肌注和尼古丁灌胃构建血管钙化模型,检测血浆及组织中乳酸水平,并取胸主动脉进行间接体内乳酸干预。茜素红S与Von Kossa硝酸银染色法观察胸主动脉钙结节形成;盐析法检测胸主动脉钙含量;免疫组织化学染色法与Western blot检测组织中成骨表型分子、凋亡相关分子、线粒体分裂及自噬相关分子表达;检测线粒体呼吸复合物酶活性及ATP含量改变。结果:（1）与正常大鼠相比,血管钙化大鼠血浆及组织中乳酸水平显著升高。（2）与对照组相比,外源性乳酸促进大鼠胸主动脉成骨表型转化（RUNX2与BMP2表达升高）与钙盐沉积。（3）外源性乳酸诱导Drp1移位至线粒体,促进线粒体分裂（OPA1表达降低、Mff与Drp1表达升高）,抑制整体自噬水平（LC3-II表达降低、p62表达升高）及BNIP3介导的线粒体自噬（线粒体膜蛋白表达减少、BNIP3表达增加）,并诱导线粒体相关凋亡（Bax与Cleaved-Caspase-3表达升高、Bcl-2表达降低）。（4）与对照组相比,外源性乳酸干预组线粒体呼吸链复合物酶活性受损,ATP生成减少。结论:钙化诱导血管组织乳酸堆积,外源性乳酸干扰线粒体动态变化与线粒体自噬,诱导内源性线粒体相关凋亡,促进大鼠胸主动脉钙化。第三部分乳酸调控线粒体分裂与自噬促进血管平滑肌细胞钙化的作用机制目的:研究外源性乳酸对大鼠血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells,VSMCs）钙化的作用及机制。方法:提取大鼠胸主动脉来源VSMCs,使用β-甘油磷酸（β-glycerophosphate,β-GP）构建VSMCs钙化模型。检测胞内及胞外乳酸水平;2-NBDG探针检测细胞葡萄糖吸收率;茜素红S染色法观察VSMCs钙结节形成;盐析法检测VSMCs中钙含量;CCK-8检测细胞活力;DHE探针检测VSMCs中活性氧生成;TUNEL法检测VSMCs凋亡;使用Mito-Tracker Red在激光共聚焦显微镜下观察线粒体形态变化;使用GFP-m RFP-LC3双标腺病毒转染VSMCs观察胞内自噬流情况;使用Mito-Tracker Red与Lyso-Tracker Green标记线粒体与溶酶体,观察两者共定位情况;JC-1探针检测线粒体膜电位;利用透射电镜直接观察线粒体形态与结构改变;检测线粒体呼吸复合物酶活性及ATP含量改变;Western blot检测VSMCs中成骨表型分子、凋亡相关分子、线粒体分裂及自噬相关分子的表达;最后验证NR4A1/DNA-PKcs/p53信号通路在乳酸调控线粒体分裂与自噬中的作用;结果:（1）钙化诱导促进VSMCs葡萄糖吸收及胞内外乳酸生成。（2）外源性乳酸通过NR4A1/DNA-PKcs/p53信号通路诱导激活Drp1介导的线粒体分裂（Drp1由胞质移位至线粒体;线粒体形态转变为点状;线粒体分裂相关分子Drp1与Mff等表达降低）,并减少胞内自噬通量（LC3-II表达减少、p62表达增加;GFP-m RFPLC3双标腺病毒转染细胞后,显示自噬体与自噬溶酶体数量均减少）,抑制BNIP3介导的线粒体自噬（BNIP3表达降低、线粒体膜蛋白水平增加;线粒体与溶酶体融合减少）,促进线粒体膜转换孔开放,干扰线粒体膜电位,破坏线粒体结构,最终导致线粒体呼吸链复合酶活性受损,ATP生成减少,胞内活性氧增多,启动内源性线粒体凋亡途径（TUNEL阳性细胞增加;Bax与Cleaved-Caspase-3表达升高、Bcl-2表达降低）,促进大鼠VSMCs成骨表型转化与钙盐沉积。（3）BNIP3过表达减轻VSMCs钙化。结论:钙化诱导VSMCs胞内外乳酸堆积,外源性乳酸通过NR4A1/DNA-PKcs/p53信号通路激活Drp1介导的线粒体分裂,抑制BNIP3介导的线粒体自噬,启动内源性线粒体凋亡途径,加速VSMCs钙化。