昆虫是地球上存在数量最多的动物群体,其体内的血淋巴流淌在各组织间隙形成了开放性的循环系统来发挥物质运输,营养代谢以及免疫防御等作用。家蚕是重要的经济昆虫之一,经历几千年的驯化过程,它也成为了重要的模式昆虫。家蚕的血淋巴中含有大量的蛋白质,如30K蛋白、血淋巴蛋白酶、蛋白酶抑制剂、营养储藏蛋白等。其中,丝氨酸蛋白酶抑制剂作为重要的调控因子,在家蚕的生长发育以及免疫过程中发挥着重要的作用。目前关于丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究报道较多的是Serpin类家族,对其他家族如Kunitz、Kazal以及粘液家族功能研究还较少。本实验室赵萍等人在前期的研究中从家蚕基因组中鉴定到80个丝氨酸蛋白酶抑制剂。家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂具有比较广泛的分布特征,如Bm SPI38、Bm SPI39在丝腺中表达并且可以抵抗真菌的感染,而Serpin5、Serpin32则分布在血淋巴中参与调控家蚕体液免疫中的黑化作用。先前的研究中,不同家蚕品系的血淋巴中发现了较多的丝氨酸蛋白酶抑制剂,它们中很多属于胰凝乳蛋白酶抑制剂（Chymotrypsin Inhibitor,CI）,研究者根据电泳迁移率的不同将其命名为CI-1～CI-13。目前家蚕中关于CI的研究还比较少,虽然有较多天然分离纯化的报道,但对其功能的认识仍很有限。基于本实验室前期的研究,我们发现家蚕CI-13是一种在各品系分布广泛,且在血淋巴丰度较高的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂。丝氨酸蛋白酶抑制剂在生物体中具有广泛的调节作用。然而,到目前为止,CI-13的功能仍是未知。因此,有必要对CI-13这种在家蚕各品系中高丰度表达的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂的功能进行深入研究。本研究以家蚕为研究对象,通过生物信息学方法对家蚕含有Kunitz型结构域的蛋白进行了鉴定,进一步通过基因克隆,蛋白表达纯化,以及遗传操作和体外生理生化等实验对CI-13进行了研究。本研究获得的主要成果如下:1.家蚕含Kunitz结构域蛋白的鉴定与分析根据Kunitz结构域的Pfam区编号,利用HMMER软件构建隐马可夫模型并在家蚕的Silkbase,Silk DB3.0及NCBI数据库中查找含有Kunitz结构域的蛋白,共在家蚕中鉴定到18个含有Kunitz结构域的蛋白,该家族蛋白的酸碱性、蛋白分子量、组织分布特征差异较大。其中,CI-13在该家族中表达量较高,含有一个Kunitz结构域,具有信号肽属于可分泌性蛋白,预测分子量为9.61 k Da。其P1活性位点是苯丙氨酸,Kunitz结构域中具有6个保守的半胱氨酸,模拟三维结构发现CI-13由C端为α螺旋和两个反平行β折叠片构成,具有典型的Kunitz结构特征。与其他物种中Kunitz型的胰凝乳蛋白酶抑制剂的系统进化树分析表明,CI-13与家蚕CI-b1以及野桑蚕中的组织因子途径抑制进化关系较近,而与其他物种,如果蝇、斜纹夜蛾、棉铃虫等昆虫的成员因进化关系较远而聚在不同分支上。2.家蚕CI-13的原核表达纯化及表达特征分析以家蚕脂肪体c DNA为模板,我们成功克隆了CI-13基因。将CI-13编码区（去除信号肽）与p28原核表达载体成功连接后转入BL21转化菌株中,经过诱导后,CI-13主要是在37℃以包涵体形式表达。利用尿素变性并在透析袋中复性的方法获得可溶形式的重组CI-13蛋白,接着利用镍柱亲和层析及凝胶过滤层析分别纯化获得高纯度的重组CI-13蛋白。为了验证复性纯化后的蛋白是否有活性,我们进行了活性胶染色,发现重组CI-13对胰凝乳蛋白酶具有明显的抑制活性。利用不同的温度和p H处理重组CI-13蛋白,发现其仍然具有抑制活性,表明其具有很好的稳定性。并且,通过圆二色谱（CD）分析发现CI-13蛋白二级结构中的α螺旋在高温处理后也有一定程度的恢复,进一步说明该蛋白稳定性比较好。酶活抑制实验证明CI-13可以明显抑制胰凝乳蛋白酶活性,对胰蛋白酶活性具较弱的抑制作用。此外,组织时空表达谱分析表明,CI-13在家蚕脂肪体中表达量较高,从四龄三天到蛹一天在脂肪体中持续表达,其主要由脂肪体合成分泌到血淋巴中,并分布在血细胞表面。这些结果表明,家蚕CI-13可能在脂肪体和血淋巴等免疫组织中发挥功能。3.家蚕CI-13的免疫功能探究通过向家蚕体内注射病原相关分子模式（PAMPs）后,发现脂肪体中CI-13的表达被上调,暗示其可能参与家蚕免疫过程。为了检测CI-13是否可以参与对抗菌肽基因的表达调控,我们通过注射CI-13重组蛋白并用藤黄微球菌诱导免疫通路,发现CI-13可以正调控抗菌肽的表达。进一步的ELISA和Western blot试验证明,CI-13蛋白能与病原物结合,但不能作为免疫效应物直接抑制细菌、真菌的生长。随后,利用CRISPR/Cas9技术敲除了CI-13。通过定量PCR和Western blot检测发现,在敲除CI-13后,脂肪体和血淋巴中抗菌肽的表达显著降低。在注射不同种类的细菌和真菌后,与对照组家蚕相比,敲除CI-13组家蚕的存活率降低。利用酶活试验检测CI-13对酚氧化酶（PO）活性的影响,发现重组CI-13蛋白能显著抑制病原相关分子模式诱导的的PO活性。同样地,我们按照相同方式检测了敲除组血淋巴中PO的活性,发现敲除组家蚕血淋巴中PO活性明显高于对照组,这暗示家蚕CI-13可以通过抑制血淋巴中PO的活性来调控黑化反应的水平。基于以上研究结果,我们推测家蚕CI-13不仅可以作为免疫识别分子,正调控抗菌肽的表达,而且可以通过调控黑化反应的水平,充当免疫稳态调控分子。