研究目的白桦脂醇（Betulin）是一种羽扇豆烷型的五环三萜类化合物,存在于中药酸枣仁中,且在白桦树的树皮中含量较高,资源较为丰富。相关药理学研究表明,白桦脂醇具有抗肿瘤、抗病毒、消炎等多种生物活性,拥有良好的研究前景。然而,作为天然产物,白桦脂醇存在一些缺点,例如,溶解性差,吸收困难,生物活性相对较弱,这一系列问题制约其进一步开发与应用。本课题组在以往研究中,基于川芎药对和拼合原理设计,将中药川芎的活性成分川芎嗪（TMP）与多种中药活性分子拼合,起到了提高中药活性成分的生物活性并降低其毒副反应的效果。此外,研究表明,一些天然产物中引入氨基酸后,能很大程度地改善其溶解性,同时能显著提高其药效活性,降低其不良反应。因此,本研究基于药物拼合的研究思路,以中药活性分子白桦脂醇为母核,通过化学的方法,在其结构上引入川芎嗪与不同种类的氨基酸及乙酰氨基酸分子,以期发现生物活性好,毒副作用小的新型白桦脂醇衍生物。研究方法本研究基于临床用药实践及药物化学的拼合原理,选择中药活性成分白桦脂醇为基本母核,以酯化反应为技术手段,首先在白桦脂醇28位羟基处引入川芎嗪分子,得到先导化合物川芎嗪-白桦脂醇（TB）,继续通过酯化反应及酰胺反应,在白桦脂醇3位羟基处进行修饰,引入氨基酸与乙酰氨基酸,得到了一系列的（川芎嗪-）白桦脂醇-氨基酸类以及乙酰二肽类衍生物。并选择HepG2（肝癌细胞）,BGC-823（胃癌细胞）,HeLa（宫颈癌细胞）,HT-29（结肠癌细胞）4种肿瘤细胞模型和1种正常细胞MDCK（犬肾上皮细胞）,利用MTT法对该系列白桦脂醇衍生物的体外抗肿瘤细胞增殖活性及对正常细胞的细胞毒性进行评价;再进一步结合Giemsa,DAPI,AO/EB染色法探究白桦脂醇及氨基酸衍生物TB-01对HepG2细胞形态的影响,利用流式细胞术初步考察TB-01抑制HepG2细胞增殖的作用机制。研究结果化学方面,得到新型白桦脂醇衍生物19个,均通过1H-NMR、13C-NMR以及HR-MS对化合物的结构进行了确认,并完成相关理化参数的测定;生物活性方面,MTT法评价了衍生物的体外抗肿瘤活性,实验结果表明,大多数TB-氨基酸衍生物对4种肿瘤细胞表现出较好的抑制活性,抑制作用优于白桦脂醇及TB,其中TB-01对肿瘤细胞的抑制活性最好,与阳性药顺铂相当,且同时对正常细胞MDCK的细胞毒性弱于阳性药物顺铂,表现出一定的细胞毒选择性;结合细胞染色法及流式细胞术,发现TB-01能够阻断HepG2细胞间联系,导致细胞损伤及细胞核裂解,并能够诱导HepG2细胞出现早期凋亡,将HepG2细胞的细胞周期阻滞在G1期。研究结论本实验设计并合成得到19个新型白桦脂醇衍生物,并对该系列衍生物进行了体外的抗肿瘤活性评价。与母核白桦脂醇相比,通过在其C-3位羟基和C-28位羟基上引入川芎嗪与氨基酸类分子,有效地提高了白桦脂醇的生物活性,对肿瘤细胞的体外抑制增殖作用明显增强。其中,甘氨酸衍生物TB-01表现出非常有潜力的抗肿瘤活性,与阳性药物顺铂相当,且对正常细胞的毒性较小。构效关系分析表明,引入脂肪族氨基酸的衍生物体外抗肿瘤活性的表现要优于芳香族类氨基酸衍生物,在脂肪族氨基酸衍生物中,小分子氨基酸衍生物的生物活性强于分子量较大的氨基酸衍生物,如甘氨酸、肌氨酸衍生物活性要优于异亮氨酸与亮氨酸衍生物。而在对氨基酸衍生物的进一步修饰中,即继续引入乙酰氨基酸得到白桦脂醇乙酰二肽衍生物,并没有起到进一步提高氨基酸衍生物的抗肿瘤活性的作用。总之,本研究通过化学的手段对白桦脂醇进行了结构修饰工作,得到一系列的新型白桦脂醇衍生物,使得其体外抗肿瘤活性得到提高,进一步探究了氨基酸分子在中药活性成分结构修饰方面的作用,为中药中有效成分以及中药新药开发提供了借鉴与参考。