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产肠毒素大肠杆菌（ETEC）能够引起幼龄动物严重腹泻,如仔猪黄白痢与水肿病,其高致病率和高死亡率给养殖业带来极大经济损失。目前,仔猪腹泻的预防措施中,抗生素“限用”,氧化锌“限量”,灭活疫苗保护效果有限,亟需一种能够提高ETEC灭活疫苗免疫保护效果的物质。毕赤酵母能够提高断奶仔猪生产性能、降低腹泻率并增强肠道屏障功能,但尚未有其能否增强疫苗免疫效果的研究报道,故本研究探讨了添加毕赤酵母对ETEC灭活疫苗的免疫增强作用。第一部分将毕赤酵母活菌、灭活菌及其总RNA与灭活疫苗共同注射于小鼠模型,以分析毕赤酵母及其组分能否增强ETEC灭活疫苗的免疫效果。首先在预实验中确定了 BALB/c小鼠模型的ETEC K88ac半数致死量（LD50）为3×107CFU/mL。随后,将80只小鼠随机分为5组,分别肌注ETEC灭活疫苗、毕赤酵母活菌+疫苗、毕赤酵母灭活菌+疫苗、毕赤酵母总RNA+疫苗、生理盐水。在免疫后第15 d随机选取8只小鼠采血并处死收集肠液与十二指肠,经ELISA检测到添加毕赤酵母活菌、灭活菌及其总RNA均提高了 ETEC灭活疫苗诱导产生的小鼠血清特异性抗体K88ac IgA和K88ac IgG（P＜0.01）以及肠液中的K88ac SIgA的水平（P＜0.01）,表明添加毕赤酵母可以提高灭活疫苗诱导的体液免疫与黏膜免疫水平。RT-qPCR检测肠道细胞因子IL-1β、IFN-γ与IL-4的相对表达量,发现与灭活疫苗对照组相比,添加毕赤酵母增加IL-1β表达量,能够激发促炎反应与免疫防御机制;经RT-qPCR检测到酵母活菌+疫苗组小鼠小肠中紧密连接蛋白Occludin、ZO-1与黏蛋白MUC2的表达量均极显著高于其他各组（P＜0.01）。观察十二指肠组织切片发现酵母活菌+疫苗组绒毛高度极显著高于其他各组（P＜0.01）;与生理盐水对照组相比,添加酵母活菌组的隐窝深度极显著降低（P＜0.01）;定量分析计算绒隐比得出,与其他各组相比,添加酵母活菌极显著提高小鼠小肠绒隐比（P＜0.01）。酵母活菌+疫苗组小鼠的脾脏指数显著高于酵母灭活菌+疫苗组（P＜0.05）,极显著高于酵母总RNA+疫苗组、灭活疫苗组与生理盐水组（P＜0.01）;在免疫后15 d对各组小鼠进行ETEC攻毒,与其他各组相比,添加酵母活菌极显著降低了小鼠腹泻率（P＜0.01）、显著降低了死亡率（P＜0.05）,显著增高了体重维持率（P＜0.05）。以上结果表明,毕赤酵母及其组分与ETEC灭活疫苗共同肌注,能够增强灭活疫苗的免疫效果,其中毕赤酵母活菌效果最佳。第二部分预先对小鼠模型灌胃或肌注不同剂量的毕赤酵母活菌,以进一步研究不同免疫方式和剂量对毕赤酵母活菌免疫增强效果的影响。将144只BALB/c小鼠随机分为8组,分别为灌胃生理盐水+ETEC灭活疫苗组（Migv）、灌胃低剂量毕赤酵母活菌+疫苗组（Migl）、灌胃高剂量酵母活菌+疫苗组（Migh）、灌胃生理盐水组（Mign）、肌注生理盐水+疫苗组（Mimv）、肌注低剂量酵母活菌+疫苗组（Miml）、肌注高剂量酵母活菌+疫苗组（Mimh）、肌注生理盐水组（Mimn）。首先Migl、Migh、Miml与Mimh组预先连续7 d灌胃或肌注低/高剂量酵母活菌,Migv、Mign、Mimv与Mimn组连续7 d灌胃或肌注生理盐水。各组小鼠体重变化未呈现统计学差异（P＞0.05）,且未产生肝毒性。第8d,Migv、Migl、Migh、Mimv、Miml与Mimh组肌注等量ETEC灭活疫苗,Mign与Mimn组肌注等量生理盐水。免疫后15 d,各组随机选取8只小鼠采血并采集十二指肠组织与小肠液,检测到预先肌注毕赤酵母活菌组的血清特异性免疫球蛋白K88ac IgA、K88ac IgG与肠液K88ac SIgA水平均极显著高于灌胃组（P＜0.01）,表明肌注毕赤酵母更能够提高灭活疫苗诱导的体液免疫与黏膜免疫水平。预先灌胃高剂量酵母活菌上调了肠道IL-1β的相对表达量,各组间IFN-γ/IL-4无差异显著性（P＞0.05）。灌胃高剂量毕赤酵母组的小鼠小肠中Occludin、MUC2及ZO-1的mRNA表达量均极显著或显著高于相应的低剂量组（P＜0.01,P＜0.05）,平均绒毛高度极显著高于低剂量组（P＜0.0 1）。定量分析得出灌胃高剂量酵母组平均绒隐比极显著高于肌注高剂量酵母组（P＜0.01）,表明灌胃毕赤酵母对小鼠肠道结构及屏障功能更加有益。收集粪便进行肠道菌群测序,得出灌胃高剂量酵母活菌组的Chao1指数高于肌注高剂量酵母活菌组（P＜0.05）,且灌胃酵母活菌组比肌注酵母活菌组的小鼠粪便肠道菌群更为丰富。灌胃酵母组小鼠粪便中梭状芽孢杆菌属、粘放线菌属等有益菌属增多;肌注高剂量酵母组小鼠粪便中乳酸杆菌属、屈螺菌属、普雷沃氏菌属、文肯菌属、梭状芽孢杆菌属与瘤胃球菌属等有益菌属增多。肌注高剂量酵母活菌组的小鼠脾脏指数最高。在免疫15 d后对各组剩余小鼠进行ETEC攻毒试验,肌注高剂量酵母活菌组小鼠的存活率和体重维持率也高于其他各组。以上试验结果表明,肌注毕赤酵母活菌更加显著提高了疫苗的特异性免疫水平和免疫保护效果;灌胃毕赤酵母也提高了疫苗的免疫效果,但其作用更倾向于提高肠道屏障完整性、肠道菌群丰度和肠道健康。综上所述,本研究发现添加毕赤酵母活菌、灭活菌及其总RNA均可以增强ETEC灭活疫苗的免疫效果,其中毕赤酵母活菌效果最佳。预先灌胃高剂量毕赤酵母活菌在提高ETEC疫苗诱导的黏膜免疫水平上发挥更大优势,预先肌注高剂量毕赤酵母活菌在提高ETEC疫苗诱导的体液免疫上发挥更大优势,且两种给药方式均增强了 ETEC灭活疫苗的免疫效果,本研究为酵母类佐剂的研发及其相关机制研究提供了理论依据。