目的：　　 RegⅣ基因是再生基因家族（regenerating gene family）中的一员，定位于染色体lp12-13.1，表达一种由158个氨基酸组成的分泌性蛋白，包括一个保守的钙依赖碳氢化合物识别域（carbohydrate-recognition domain CRD）。RegⅣ蛋白主要表达于胃黏膜壁细胞和小肠上皮神经内分泌细胞，与胃上皮细胞的增殖分化及肿瘤的发生、浸润、转移、5-氟脲嘧啶（5-FU）抗药性以及临床预后相关。而在结直肠癌仅有表达上调的报道，对结直肠癌LoVo细胞生物学行为的实验研究及其CRD结构域的作用未见报道。我们的研究拟通过基因转染技术观察RegⅣ基因及其CRD结构域对人结直肠癌LoVo细胞生物学行为的影响，通过裸鼠成瘤实验研究裸鼠结直肠癌移植瘤生长及其机理。　　 方法：　　 1.采用RT-PCR技术和免疫细胞化学分别检测RegⅣ基因在人结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中的表达水平。　　 2.采用SOE-PCR技术扩增RegⅣ缺失CRD结构域片段（RegⅣ△CRD）。构建重组质粒pcDNA3.1-RegⅣ和pcDNA3.1-RegⅣ△CRD，转染表达阴性的LoVo细胞。RT-PCR检测转染前后细胞中RegⅣ和RegⅣ△CRD的mRNA表达。应用针对羊抗人RegⅣ基因CRD结构域位点的多克隆抗体进行免疫细胞化学检测转染前后细胞中RegⅣ和RegⅣ△CRD的蛋白表达改变。　　 3.MTT比色法和平板克隆形成实验观察转染前后四组细胞的增殖状况；侵袭小室实验及迁移实验检测转染前后细胞侵袭能力的改变；流式细胞技术检测转染前后的细胞凋亡改变。　　 4.用80 p mol/L浓度的抗肿瘤药物5-氟脲嘧啶（5-FU）干预转染RegIV基因前后的LoVo细胞，MTT比色法和平板克隆形成实验观察5-FU干预后各组细胞增殖状况；流式细胞技术检测细胞凋亡。　　 5.裸鼠皮下分别接种LoVo、LoVo/空载、LoVo/RegⅣ△CRD和LoVo/RegⅣ四组细胞，观察各组移植瘤生长情况，比较移植瘤体积及重量。移植瘤组织HE染色，观察肿瘤组织形态。　　 6.RT-PCR检测四组移植瘤组织RegⅣ和RegⅣ△CRD基因mRNA表达。　　 7.构建裸鼠移植瘤组织芯片，免疫组织化学检测四组移植瘤组织Ki-67、VEGF、CD34的表达，计算各组移植瘤组织的MVD。并进行相关性分析.　　 结果：　　 1.人结直肠癌细胞株HT-29中RegⅣ/mRNA及蛋白呈阳性表达，LoVo的表达呈阴性。　　 2.应用SOE-PCR技术成功获得长度为118bp的RegⅣ缺失CRD结构域片段，即RegⅣ△CRD。　　 3.成功构建真核表达载体pcDNA3.1-RegⅣ和PcDNA3.1-RegⅣ△CRD；转染LoVo细胞后，RegⅣ基因mRNA和RegⅣ基因CRD结构域位点编码蛋白呈阳性表达。RegⅣ△CRD mRNA呈阳性表达，RegⅣ基因CRD结构域位点编码蛋白呈阴性表达。　　 4.MTT结果显示转染后LoVo/RegⅣ与LoVo/RegⅣ△CRD细胞及LoVo细胞增殖活性无明显差异（P>0.05）；平板克隆形成实验显示LoVo/RegⅣ与LoVo/RegⅣ△CRD细胞及LoVo细胞的克隆形成数量无明显差异（P>0.05）。流式细胞仪检测结果显示LoVo/RegⅣ与LoVo/RegⅣ△CRD及LoVo细胞凋亡率无明显差异（P>0.05）；侵袭实验结果显示LoVo/RegⅣ细胞穿过人工构建基底膜的数目明显多于LoVo细胞（P<0.05），提示转染后细胞侵袭能力增强；迁移实验显示LoVo/RegⅣ细胞迁移至Transwell下室的细胞数目明显多于LoVo细胞（P<0.05），提示转染后细胞迁移能力明显增强。LoVo/RegⅣ△CRD细胞与LoVo细胞在迁移及侵袭能力方面无明显差异（P>0.05）。　　 5.80μ mol/L浓度5-FU干预48h后，MTT结果显示LoVo细胞增殖活性明显弱于转染后LoVo/RegⅣ细胞（P<0.05）；平板克隆形成实验显示LoVo细胞形成的克隆数比LoVo/RegⅣ细胞数少（P<0.05）。流式细胞仪检测结果显示LoVo/RegⅣ细胞凋亡率明显低于LoVo细胞（P<0.05）。提示RegⅣ表达可能与LoVo/RegⅣ细胞对5-FU抗药性有关。LoVo/RegⅣ△CRD细胞在增殖活性、平板克隆形成能力及细胞凋亡率方面与LoVo细胞均无明显差异（P>0.05）。提示RegⅣ基因的5-FU抗药性与其CRD结构域密切相关。　　 6.接种后，各组裸鼠的成瘤率均为100％，平均成瘤时间为（7±1）d。随瘤龄增长，肿瘤逐渐增大。接种15d，四组裸鼠的移植瘤重量及体积均无组间明显差异。移植瘤组织HE染色，显微镜下观察，LoVo、LoVo/空载、LoVo/RegⅣ△CRD及LoVo/RegⅣ细胞组可见散在点状坏死。四组移植瘤免疫组化检测Ki-67表达均为（+++），组间比较无显著性差异（P>0.05）。提示RegⅣ基因对移植瘤细胞的增殖无明显影响。　　 7.RT-PCR技术检测LoVo/RegⅣ细胞组移植瘤组织稳定表达RegⅣmRNA，LoVo/RegⅣ△CRD细胞组移植瘤组织稳定表达RegⅣ△CRD mRNA，LoVo与LoVo/空载细胞组移植瘤组织RegⅣ和RegⅣ△CRD基因mRNA表达阴性。提示转染/RegⅣ及RegⅣ△CRD基因在移植瘤细胞中能够稳定表达。　　 8.成功构建组织芯片，组织点阵列模块排列整齐，组织学可观察率为100％。LoVo/RegⅣ细胞组移植瘤组织VEGF表达为（+++），与其他各组比较有显著性差异（P<0.05）。LoVo/RegⅣ△CRD、LoVo、LoVo/空载移植瘤组织VEGF表达均为（++），无组间差异（P>0.05）。LoVo/RegⅣ移植瘤组织MVD为42.56±3.21，明显高于其他三组（P<0.05）；LoVo/RegⅣ△CRD、LoVo、LoVo/空载移植瘤组织MVD分别为28.12±2.39，30.41±2.93，28.58±2.93，无组间差异（P>0.05）。提示RegⅣ基因转染与调控肿瘤的血管新生有关，并且其作用与CRD结构域相关。　　 结论：　　 1.RegⅣ基因在两种人结直肠癌细胞株中表达不同。在HT-29细胞株高表达，LoVo细胞株阴性表达。　　 2.RegⅣ基因表达可以增强LoVo细胞的侵袭和迁移能力，而对细胞的增殖活性，平板克隆形成能力及细胞的凋亡无明显影响。提示RegⅣ基因可能与肿瘤的侵袭和转移有关。敲除CRD结构域的RegⅣ基因对细胞增殖、凋亡、侵袭无明显影响。　　 3.5-FU干预对LoVo/RegⅣ细胞在增殖活性、平板克隆形成能力及诱导凋亡方面的影响弱于LoVo细胞及LoVo/空载细胞。提示RegⅣ基因表达与肿瘤的5-FU抗药性有关，可能是导致临床化疗失败的原因之一。敲除CRD结构域的RegⅣ基因对细胞的5-FU抗药性无明显影响。　　 4.裸鼠体内成瘤实验结果显示，RegⅣ及RegⅣ△CRD基因转染LoVo细胞，对肿瘤细胞的增殖的作用无明显影响。　　 5.RegⅣ基因转染可促进LoVo细胞的VEGF表达，增加LoVo/RegⅣ组移植瘤的MVD，提示RegⅣ基因转染与调控肿瘤的血管新生有关。RegⅣ△CRD基因转染对LoVo细胞的VEGF表达及LoVo/RegⅣ△CRD组移植瘤的MVD影响不明显，提示RegⅣ基因对结直肠癌LoVo细胞的生物学行为影响可能系通过其保守的CRD结构域发挥作用。　　 综上研究结果提示：RegⅣ可能是一个癌基因，与肿瘤的转移、5-氟脲嘧啶抗药性及肿瘤的血管生成有关，并通过其保守的CRD结构域在结直肠癌发生发展中起着重要作用。