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研究背景 胶质瘤（Gliobla）是颅内发病率最高的原发性恶性肿瘤,占所有颅内原发肿瘤的50%以上,其中超过50%的胶质瘤是WHO Ⅳ级的胶质母细胞瘤（Glioblastoma Multiforme,GBM）。目前,临床上胶质瘤的标准化治疗方案为手术切除,辅以术后同步放化疗。虽然近年来针对胶质瘤的外科手术治疗、放化疗、基因治疗、免疫治疗等治疗的研究均有重大进展,但临床上胶质瘤病人预后差,复发率和死亡率高。替莫唑胺（Temozolomide,TMZ）,是目前治疗胶质瘤的一线化疗药物,但TMZ耐药已成为导致治疗失败的重要原因。因此,进一步研究胶质瘤耐药的分子机制,寻找可能的特异性治疗方法亟待解决。外泌体（Exosome）,是30-150纳米范围内的囊泡状结构,由体内所有类型的细胞分泌,包含多种多样成分,包括蛋白质、脂质、RNA、DNA等,在细胞间的物质进行交换和生物学功能特性信息传递起到了一个重要影响作用。外泌体作为人体内一类重要的运输小泡,其作用正受到越来越多的研究和关注。外泌体能参与到肿瘤免疫细胞的生长增殖、血管系统生成、化疗耐药等重要的生物教学过程,肿瘤相关细胞能通过自身分泌外泌体,将其内包含的信号知识分子转移到远处组织和细胞中,从而能够起到积极发挥介导调控的作用。巨噬细胞迁移抑制因子（Macrophage migration inhibitory factor,MIF）,是一种促炎多功能细胞因子,最初于1966年被发现。前期研究表明MIF在许多肿瘤中过表达,新近研究表明MIF与肿瘤的化疗抗性有关。作为一种分泌性细胞因子,MIF被发现在肿瘤患者的血浆的外泌体内高表达并可促进肿瘤的恶性进展。然而,外泌体MIF是否有助于胶质瘤中的TMZ抗性仍有待阐明。因此,本研究的目的是探索MIF是否参与了胶质瘤TMZ耐药的形成,是否通过外泌体途径靶向调控TIMP3/PI3K/AKT通路介导胶质瘤TMZ耐药。通过研究这些问题,试图为胶质母细胞瘤的治疗提供新的药物靶点和治疗策略。研究目的 明确外泌体内MIF在胶质瘤TMZ耐药进展中的作用及其临床意义,并探讨MIF通过TIMP3调控PI3K/AKT通路在脑胶质瘤TMZ耐药中的可能机制和潜在临床应用价值。研究方法 前期通过渐次增加培养基中TMZ浓度构建耐药细胞株TR（Temozolomide Resistant）,通过 ELISA 和 WB 分别检测 TS（Temozolomide Sensitive）与 TR细胞上清液中MIF的含量及细胞内MIF的表达情况,且在不同质量浓度TMZ处理下MIF的表达量变化情况。应用CCK8法、EdU染色与流式细胞术明确MIF对胶质瘤细胞增殖、凋亡及TMZ敏感性的影响;提取外泌体并检测其中MIF的表达量;将TR外泌体标记PKH26后加入TS细胞上清液中共培养,采用共聚焦显微镜拍摄其入胞情况并验证TS细胞MIF含量的变化及增殖、凋亡、化疗敏感性变化情况。稳定敲低U87中MIF进行RNA测序,筛选出差异高表达基因TIMP3,并通过RT-qPCR及WB验证MIF与TIMP3的调控关系。进一步细胞功能分析,以明确MIF是否通过调控TIMP3参与TMZ耐药并分析具体分子机制。动物实验体内验证外泌体介导MIF调控TMZ耐药进程,以及验证MIF小分子抑制剂ISO-1对TR细胞的化疗敏感性作用。研究结果 1、MIF表达量在高级别胶质瘤和复发胶质瘤病人中显著增高,其高表达与临床预后呈负相关。2、MIF可促进胶质瘤耐药,敲低MIF可明显抑制TR细胞的增殖能力,促进TR细胞凋亡,恢复TR细胞的化疗敏感性;而在TS细胞中过表达MIF能促进TS细胞增殖,减少TS细胞凋亡,增强TS细胞化疗耐药性。3、MIF可通过外泌体途径自TR细胞进入TS细胞。将TR细胞提取的外泌体用PKH26染色后,加入U87-GFP、U251-GFP细胞上清液中共培养,共聚焦荧光显微镜分析发现U87TR、U251TR的外泌体通过内吞途径进入U87、U251内并上调其MIF的基因和蛋白水平。4、外泌体MIF可通过促进增值、抑制凋亡而促进TS细胞TMZ耐药。将不同类型外泌体加入TS细胞上清液中共培养2天后发现:TR EXO能促进TS细胞增殖、抑制TS细胞凋亡进而导致TS细胞化疗耐药,TR-MIF-sh EXO对TS细胞的增殖、凋亡和化疗敏感性的影响则显著减弱。另外,TREXO和TR-NC EXO明显降低受体TS细胞中凋亡相关蛋白（caspase-3和caspase-9）的表达水平。5、TIMP3可能是MIF的下游靶点。稳定敲低U87内MIF后通过RNA-Seq测序分析发现金属蛋白酶组织抑制剂-3（Tissue inhibitors of metalloproteinases-3,TIMP3）可能是MIF在胶质瘤细胞中极有可能的下游靶点。TCGA和CGGA队列分析显示MIF与TIMP3表达水平呈显著负相关。进一步的实验证实,TR细胞中敲低MIF后,TIMP3在Mrna和蛋白水平上均上调。6、MIF通过调控TIMP3/PI3K/AKT信号通路介导胶质瘤TMZ耐药。敲低TIMP3可以显著抑制TR-MIF-sh细胞中的细胞凋亡。EdU染色显示,在TR-MIF-sh细胞中敲除TIMP3后,增殖细胞的百分比增加。回复实验表明,稳定敲低TIMP3可以逆转由敲低MIF引起的IC50值的下降。WB分析表明,稳定敲低MIF表达可抑制PI3K/Akt信号通路的激活,在TR-MIF-sh细胞中敲除TIMP3可以逆转这些蛋白质的变化。7、外泌体内MIF在体内促进胶质瘤TMZ耐药。动物体内实验结果表明:外泌体内MIF可在体内促进了胶质瘤TMZ耐药,而MIF小分子抑制剂ISO-1可以逆转这种TMZ耐药。结论 1、MIF表达上调可促进胶质瘤TMZ耐药并提示病人预后不良;2、MIF可促进细胞增殖并抑制细胞凋亡而增强胶质瘤TMZ耐药性;3、MIF可通过外泌体自TR细胞进入TS细胞传递TMZ耐药性;4、外泌体途径MIF可通过抑制TIMP3表达而激活PI3K/AKT通路促进胶质瘤TMZ耐药;