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目的:心肌梗死是冠状动脉闭塞,血流中断,使部分心肌因严重的持久性缺血而发生局部坏死所引起的病症,严重威胁人类健康。在心梗区会产生较多的活性氧化物,使得心肌发生氧化应激反应最终导致心肌细胞凋亡,其中H2O2是较常见的活性氧化物。由于心肌是终末分化细胞,一旦损伤后只能由纤维组织所代替,常规治疗手段不能逆转已经坏死的心肌细胞。而干细胞移植治疗心肌梗塞被认为是前景光明的治疗手段,其中骨骼肌成肌细胞与心肌细胞都来源于中胚层,具有可以自体移植等理想特性,移植治疗心梗效果显著。但移植细胞在宿主心肌中的存活率直接影响了治疗效果,经实验证实移植后3天内70%-80%的移植细胞死亡,其最主要的原因是在缺血环境下发生氧化应激而引起的细胞凋亡。近些年一些研究发现,micro RNAs(mi RNAs)对细胞的增殖、分化、凋亡等过程有一定的调控作用,而且不同的mi RNAs的作用也不尽相同,其中mi RNA-214(mi R-214)是mi RNAs家族的重要成员。研究表明mi R-214对氧化应激损伤的心肌具有一定的保护作用,对正常成肌细胞增殖分化也有调节作用。因此本实验拟建立体外L6骨骼成肌细胞(L6 Skeletal Myobalst,L6SKM)H2O2损伤模型,观察mi R-214在不同损伤条件下的表达调节,并通过提前给予mi R-214前体和抑制剂,上调和下调mi R-214的表达,观察成肌细胞在氧化应激条件下的增殖与凋亡变化,并探讨其机制。方法:1mi R-214对L6SKM增殖的作用体外培养L6SKM,状态良好时转染mi R-214,实验分为五组(正常对照组、pre-mi R-214组、pre-scramble组、anti-mi R-214组、anti-scramble组,24小时后进行后续实验),通过实时定量PCR法(q PCR)测定各组中mi R-214的表达,MTT比色法检测各组细胞活力,免疫细胞化学技术检测各组细胞中PCNA和cyclin D1的表达,流式细胞术检测各组细胞细胞周期的变化,计算增殖指数(PI)。2分化培养不同时间,L6SKM中mi R-214、myo D、myogenin的表达体外培养L6SKM,细胞生长状态良好,当细胞融合到60%-70%时换2%马血清的培养基,分别分化培养0天、2天、4天、6天。通过实时定量PCR法(q PCR)测定各组中mi R-214、myo D、myogenin的表达。3转染mi R-214后再分化培养不同时间L6SKM中mi R-214、myo D、myogenin的表达体外培养L6SKM,状态良好时转染mi R-214,实验分为五组(正常对照组、pre-mi R-214组、pre-scramble组、anti-mi R-214组、anti-scramble组),转染后孵育24小时,换2%马血清的培养基,分别分化培养0天、2天、4天。通过实时定量PCR法(q PCR)测定各组中mi R-214、myo D、myogenin的表达。4不同浓度不同时间H2O2对L6SKM的作用体外培养L6SKM,实验分正常对照组(normal control),H2O2作用组(H2O2浓度分别是50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、300μmol/L、400μmol/L、600μmol/L,作用时间为4h),通过MTT比色法检测各组细胞活力并计算细胞存活率,实时定量PCR法(q PCR)测定各组中mi R-214的表达;300μmol/LH2O2培养L6SKM不同时间(0.5h、1h、3h、4h、5h、7h),MTT比色法检测各组细胞活力,实时定量PCR法(q PCR)测定各组中mi R-214的表达。5 mi R-214对H2O2损伤L6SKM增殖和凋亡的作用体外培养L6SKM,状态良好时转染mi R-214,转染后孵育24小时,再给予300μmol/L H2O2作用4h。实验分为六组,分别是正常对照组、H2O2组、pre-mi R-214+H2O2组、pre-scramble+H2O2组、anti-mi R-214+H2O2组、anti-scramble+H2O2组。MTT比色法检测各组细胞活力,免疫细胞化学染色检测PCNA和cyclin D1的表达,流式细胞技术方法检测细胞周期计算增殖指数(PI)和细胞凋亡,Western blotting法检测caspase-3、Bcl-2、BAX蛋白表达。结果:1mi R-214对L6SKM增殖的影响q PCR检测结果显示pre-mi R-214组mi R-214表达水平明显高于正常对照组,anti-mi R-214能够明显抑制mi R-214表达,而正常对照组和pre-scramble组、anti-scramble组mi R-214表达无差异,说明转染成功。MTT比色法结果显示与正常对照组相比pre-mi R-214组细胞活力明显增加,anti-mi R-214组细胞活力明显降低,pre-scramble组和anti-scramble组细胞活力和正常对照组无差异。流式细胞技术检测细胞周期结果显示pre-mi R-214组细胞PI值高于正常对照组,anti-mi R-214组细胞PI值低于正常对照组。免疫细胞化学方法检测结果显示pre-mi R-214组PCNA、cyclin D1的表达高于正常对照组,anti-mi R-214组则低于正常对照组。以上结果表明mi R-214在生长培养基中可以促进L6SKM增殖。2分化培养不同时间,L6SKM中mi R-214、myo D、myogenin的表达q PCR检测结果显示随着分化培养时间的延长mi R-214、myo D、myogenin的表达均逐渐升高。3 mi R-214对分化培养不同时间L6SKM中mi R-214、myo D、myogenin表达的影响q PCR检测结果显示pre-mi R-214组mi R-214、myo D、myogenin的表达均高于正常对照组和相应时间的空白对照组,且随着分化培养时间延长而逐渐增加。anti-mi R-214组mi R-214、myo D、myogenin的表达则低于正常对照组和相应时间的空白对照组。说明mi R-214在分化培养基中可以促进L6SKM分化。4 H2O2对L6SKM的作用MTT结果显示L6SKM细胞活力随H2O2浓度的升高、时间的延长而降低,呈现明显的剂量和时间依赖性。我们最终选取细胞存活率约为50%的H2O2作用浓度300μmol/L作用4h,建立氧化应激模型。q PCR检测结果显示与正常对照组相比,H2O2组中mi R-214表达逐渐上升,且随H2O2浓度和作用时间的增加而逐渐增加。5 mi R-214对H2O2损伤L6SKM增殖和凋亡的作用MTT结果显示pre-mi R-214+H2O2组L6SKM细胞活力和细胞存活率明显高于H2O2组,anti-mi R-214+H2O2组则低于H2O2组,前体空白组、抑制剂空白组和H2O2组无明显差异。免疫细胞化学方法检测结果显示pre-mi R-214+H2O2组PCNA、cyclin D1的表达明显高于H2O2组,anti-mi R-214+H2O2组低于H2O2组。流式细胞技术检测细胞增殖和细胞凋亡结果显示pre-mi R-214+H2O2组细胞PI值高于H2O2组,凋亡率低于H2O2组,而anti-mi R-214+H2O2组PI值低于H2O2组,凋亡率高于H2O2组。Western blotting结果显示pre-mi R-214+H2O2组中caspase-3和BAX的表达明显低于H2O2组,Bcl-2的表达明显高于H2O2组。anti-mi R-214+H2O2组caspase-3和BAX的表达高于H2O2组,Bcl-2的表达低于H2O2组。前体空白组、抑制剂空白组和H2O2组无明显差异。结论:1 mi R-214在生长培养基中可以促进L6SKM增殖,在分化培养基中可以促进L6SKM分化。2 H2O2损伤可以使L6SKM中mi R-214表达增加,且呈浓度和时间依赖性。3 mi R-214可以促进氧化应激损伤的成肌细胞增殖、增加存活率,抑制凋亡。mi R-214通过抑制凋亡蛋白capase3和BAX表达,增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达来抑制细胞凋亡。