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目的:急性肝功能衰竭(acute liver failure,ALF)是由急性肝细胞大量坏死引起的一种严重致死性肝病,其发生发展受到一系列因子的复杂调控。近年来,越来越多的研究报道,微小RNA(microRNA,miRNA)在包括ALF在内的多种肝脏疾病的发生与发展中起着关键性的作用。因此,明确miRNA在ALF中的功能和作用机制,有助于阐明ALF的发病过程,对于寻找治疗ALF的新靶点具有着潜在的临床价值。本研究通过体内(动物水平)和体外(细胞水平)实验探讨了 miR-214在ALF中的作用和潜在的分子机制。方法:(1)采用 800 mg/kg D-半乳糖胺(D-galactosamine,D-GalN)与10 μg/kg脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)联合用药的方式诱导建立ALF小鼠模型。采用全自动生化分析仪测量谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和血清谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)的浓度;采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法检测血清中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)和白介素6(interleukin 6,IL-6)的浓度水平;采用western blot检测肝脏组织中Caspase-3的表达水平;采用TUNEL染色试剂盒检测肝脏组织中细胞凋亡水平;验证ALF小鼠模型构建成功。(2)采用实时荧光定量 PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)技术检测 ALF模型小鼠肝脏组织中miR-214和Bax mRNA的表达水平;采用western blot检测ALF小鼠肝脏组织中Bax蛋白表达水平,明确miR-214和Bax在ALF中的表达情况。(3)采用D-GalN(1 mg/ml)与TNF-α(100 ng/ml)联合处理小鼠胚胎肝细胞株BNLCL2诱导建立肝细胞损伤模型。采用RT-qPCR检测miR-214和Bax mRNA的表达水平;采用western blot检测Bax蛋白表达水平,明确miR-214和Bax在肝细胞损伤过程中的表达情况。(4)miRNA.org等在线预测软件显示小鼠miR-214与Bax 3’UTR存在结合位点。通过构建野生型和突变型的小鼠Bax 3’UTR荧光素酶报告载体,采用荧光素酶报告实验鉴定miR-214可与Bax 3’UTR直接结合。(5)在BNLCL2细胞中转染miR-214 mimic及mimic对照,并采用D-GalN/TNF-α处理。采用RT-qPCR和western blot检测Bax mRNA和蛋白表达水平,证明miR-214可靶向抑制Bax的表达。采用Annexin V-FITC/PI染色试剂盒结合流式细胞术检测肝细胞凋亡水平,采用RT-qPCR和ELSIA检测TNF-α和IL-6的表达水平,分析miR-214的外源过表达对肝细胞凋亡以及炎症因子分泌的影响。(6)构建Bax过表达载体,将其与miR-214 mimic共转染BNLCL2细胞。通过挽救(rescue)实验进一步探讨Bax过表达能否逆转miR-214 mimic对肝细胞凋亡以及炎症因子分泌的影响。结果:(1)与对照组小鼠相比,D-GalN/LPS刺激后3h、5h、7h、9h小鼠血清AST和ALT水平显著升高,并随着时间推移逐渐升高,其中7 h时AST和ALT达到最高水平。根据该结果,我们选取了 D-GalN/LPS刺激7h作为后续研究的对象。进一步采用ELISA检测对照组小鼠和D-GalN/LPS刺激组小鼠血清TNF-α和IL-6的水平,结果发现,与对照组相比,D-GalN/LPS刺激组小鼠血清TNF-α和IL-6水平明显升高。TUNEL染色观察发现,D-GalN/LPS刺激组小鼠肝脏组织的细胞凋亡水平明显高于对照组,且Caspase-3的蛋白表达水平也明显高于对照组。以上研究结果证实采用800 mg/kg D-GalN和10 μg/kg LPS处理可成功诱导建立ALF小鼠模型。(2)与对照组小鼠相比,ALF模型小鼠肝脏组织中miR-124的表达水平显著降低,而Bax mRNA和蛋白表达水平显著增加。(3)采用D-GalN/TNF-α处理BNLCL2细胞36h成功建立肝细胞损伤模型。RT-qPCR检测发现,与对照组相比,miR-214在D-GalN/TNF-α诱导的肝细胞损伤模型中低表达,而BaxmRNA在肝细胞损伤模型中高表达。(4)荧光素酶报告实验证明miR-214与Bax 3’UTR存在结合位点,提示miR-214 与 Bax 3’UTR 结合抑制 Bax 的表达。(5)在BNLCL2细胞中转染miR-214mimic成功过表达miR-214后,检测发现Bax的mRNA表达水平和蛋白表达水平显著降低,结合荧光素酶报告实验的结果,我们可以得出:Bax是miR-214的靶基因。研究进一步发现miR-214过表达后D-GalN/TNF-α诱导的肝细胞凋亡水平显著降低,且TNF-α和IL-6的表达也显著降低,表明miR-214可抑制肝细胞的凋亡和炎症因子的分泌。(6)挽救(rescue)实验结果显示,过表达Bax(即共转染Bax表达质粒)显著逆转了 miR-214对肝细胞凋亡以及TNF-α、IL-6表达的作用,进一步说明miR-214通过靶向调控Bax的表达影响肝细胞凋亡和炎症因子分泌。结论:miR-214在ALF小鼠以及损伤肝细胞中低表达,并可通过靶向调控Bax的表达抑制肝细胞凋亡和炎症因子分泌。表明microRNA-214/Bax轴可能是ALF治疗的一个潜在干预靶点。