【摘 要】
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目的:牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis),是公认的慢性牙周炎主要致病菌。课题组前期研究发现,在P.gingivalis感染epi-4细胞过程中自噬增强、富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(protein-rich tyrosine kinase 2,Pyk2)活化,并且利用Pyk2特异性抑制剂TAE226处理后,自噬水平明显下降,提示Pyk2介导P.gingivalis感染诱
【基金项目】
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国家自然科学基金(No.81300886); 辽宁省自然科学基金(No.20180551232); 沈阳市中青年科技创新人才支持计划(No.RC170078); 沈阳市科技计划(No.F16-102-4-00);
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目的:牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis),是公认的慢性牙周炎主要致病菌。课题组前期研究发现,在P.gingivalis感染epi-4细胞过程中自噬增强、富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(protein-rich tyrosine kinase 2,Pyk2)活化,并且利用Pyk2特异性抑制剂TAE226处理后,自噬水平明显下降,提示Pyk2介导P.gingivalis感染诱发的epi-4细胞自噬。有学者发现miRNA-335-5p通过增强自噬可以减轻小鼠炎症模型中内皮细胞的炎症程度。本研究构建高/低表达miRNA-335-5p的牙龈上皮细胞,通过对P.gingivalis感染牙龈上皮细胞过程中LC3及Pyk2表达的研究,旨在揭示该菌的致病机理,为慢性牙周炎的防治提供新的靶点和思路。研究方法:1、P.gingivalis感染epi-4细胞(MOI 100:1)0、1、2、4、6、12 h后,以未感染P.gingivalis组为对照组,采用加尾法定量PCR检测miRNA-335-5p的表达情况。2、利用脂质体瞬时转染技术,将miRNA-335-5p mimic、inhibitor及其阴性对照物分别转染至epi-4细胞,转染后通过流式细胞术、加尾法定量PCR检测转染效率。3、实时定量PCR检测LC3、Pyk2 m RNA表达情况;Western blot检测LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Pyk2蛋白质水平。4、利用miRWalk软件预测miRNA-335-5p的靶基因;利用GTRD软件预测同时与LC3、Pyk2启动子区域结合的转录因子;将二者结果求取交集后结合文献选择具有负向调节作用的转录因子。结果:1、P.gingivalis感染epi-4细胞后,miRNA-335-5p表达升高,在1 h达到峰值,是对照组的6.8倍(P<0.001);2、流式细胞术检测mi NAR-335-5p mimic的转染效率为73.1%,inhibitor的转染效率为71%;加尾法定量PCR显示,mimic组miRNA-335-5p表达升高,是NC组的456倍,inhibitor组miRNA-335-5p表达下降,是NC-in组的0.42倍(P<0.05);3、mimic预处理后,与NC组相比,LC3、Pyk2 m RNA表达量升高,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Pyk2蛋白质表达增加;inhibitor预处理后,与NC-in组相比,LC3、Pyk2 m RNA表达量下降,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Pyk2蛋白质表达降低(P<0.05);4、miRWalk软件与GTRD软件预测结果求取交集后得到四种转录因子,分别是FOXA2、WT1、SP1、MAX,其中SP1具有负向调节作用。结论:P.gingivalis感染可上调epi-4细胞中miRNA-335-5p的表达,miRNA-335-5p的表达可促进Pyk2介导的epi-4细胞自噬。
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