目的:应用ITS2序列鉴定茅苍术、北苍术、关苍术、朝鲜苍术和白术,明确其种间遗传关系远近;采用水提醇沉法、高效液相色谱法对四种苍术和白术的粗多糖含量、精多糖中单糖组成和药材中单糖组成进行研究;利用薄层色谱法对四种苍术和白术的化学成分进行研究;利用GC-MS分析四种苍术和白术的挥发油成分的异同;利用ACQUITYUPLC TM-Q-TOF技术分析四种苍术和白术的化学成分异同。通过以上的研究,从遗传关系和化学成分方面探讨四种苍术和白术之间的相似性,为临床用药提供参考。材料与方法:材料:茅苍术A.lancea.采自湖北英山、北苍术A.Chinesis.和关苍术A.japonica.采自辽宁宽甸、朝鲜苍术A.coreana.采自辽宁清原、白术A.macrocephalae.采自浙江新昌,以上植物均为当地农户栽培。经辽宁中医药大学中药鉴定教研室李峰教授鉴定,分别为菊科植物茅苍术、北苍术、朝鲜苍术、关苍术和白术的根及根茎。方 法:1.提取不同栽培区茅苍术、北苍术、关苍术、朝鲜苍术和白术共40份样本以及朝鲜苍术7份野生种质样本的基因组DNA,通过PCR扩增ITS2序列并进行双向测序,所得所有序列用MEGA 5.0软件进行比对分析(clustal W),去除两端5.8S和28S序列,获得完整的ITS2序列,构建系统聚类树(NJ树)。2.采用HPLC-ELSD法检测四种苍术和白术药材中游离单糖种类和各单糖的含量。采用水提醇沉法对四种苍术和白术的药材进行处理,获得粗多糖,采用苯酚-硫酸比色法,以葡萄糖作为标准对照物,采用紫外-分光光度计外标一点法测得四种苍术和白术中粗多糖的含量。采用Sevage法对水提醇沉所得粗多糖进行沉蛋白处理得到精多糖,再经三氟乙酸水解后,采用HPLC-ELSD法检测其中单糖的种类和含量。3.四种苍术和白术药材粉末加适量甲醇后,采用超声提取,将滤液以及苍术素、苍术酮的甲醇溶液进行GF254薄层板点板,控制室温25℃,展开剂:甲苯-乙酸乙酯(7:2),且在254nm下观察荧光。喷以10%的硫酸乙醇溶液,105℃加热至斑点显色清晰,分别在自然光和365nm下观察荧光。4.采用水蒸气蒸馏法提取四种苍术和白术的挥发油,利用GC-MS分析四种苍术和白术的挥发油成分,应用Heml1.0软件对四种苍术和白术检识出的化合物数据进行处理,将所得数据进行分析,将各峰峰面积归一,计算各成分的相对百分含量。5.采用ACQUITYUPLC TM-Q-TOF系统对四种苍术和白术中的成分进行定性分析,并结合主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA),明确四种苍术和白术在化学成分上的差异。结果:1.四种苍术和白术的ITS2序列长度均为232 bp。根据NJ树和ITS2二级结构结果,除北苍术和朝鲜苍术未被区分开,其余几种药材均可明显区分,表现出良好的单系性。根据NJ树结果可知,朝鲜苍术的栽培品系和野生种质也能很好的聚在一起。2.茅苍术和关苍术中检测到的游离单糖为果糖和葡萄糖,以果糖为主,含量为10.83%和19.18%。北苍术、朝鲜苍术和白术药材中的游离单糖仅检测到果糖,含量分别为1.58%、1.43%和8.48%。四种苍术和白术中多糖含量无显著差异。四种苍术和白术精多糖的组成存在差异,各单糖的摩尔比分别为:鼠李糖:岩藻糖:果糖:葡萄糖=1:0.83:3.76:0.83(茅苍术);鼠李糖:岩藻糖:果糖:葡萄糖=1:0.77:2.46:0.46(北苍术);鼠李糖:岩藻糖:果糖:葡萄糖=1:1.05:5.88:0.97(关苍术);鼠李糖:岩藻糖:果糖:葡萄糖=1:0.67:2.76:0.73(朝鲜苍术);鼠李糖:岩藻糖:果糖:葡萄糖=1:0.7:3.24:0.49(白术)。3.在可见光下,茅苍术和北苍术的薄层斑点基本一致,朝鲜苍术、关苍术和白术的薄层斑点各有异同;以苍术素为对照品,茅苍术、北苍术和朝鲜苍术在苍术素斑点位置出现同样斑点;以苍术酮为对照品,白术和关苍术在苍术酮斑点位置出现同样斑点。在365nm荧光下,茅苍术和北苍术出现基本一致的斑点;关苍术和白术出现较为类似的斑点。在254nm荧光下,茅苍术和北苍术出现较为类似的斑点。4.从四种苍术和白术的挥发油中共鉴定出74个化合物,并首次从北苍术和朝鲜苍术中首次鉴定出萘嵌苯酮类化合物。聚类分析结果显示茅苍主、北苍术、关苍术和白术化学成分相似性较高,而朝鲜苍术单独聚为一类。5.从四种苍术和白术中共鉴定出30个化合物,其中糖苷类化合物13个;聚烯炔类化合物3个;萜类化合物12个;苯醌类化合物1个,酚酸类1个。发现有5个成分只存在茅苍术中,分别为α-香附酮、2-[(2E)-3,5-二甲基-2,4-己二烯基]-6-甲基-2,5-环己二烯-1,4-苯醌、斯巴醇、大蒜烯、Velleral;有2个成分只存在北苍术中,分别为原儿茶醛、(1,5E,11E)-十三癸三烯-7,9-二炔-3,4-二乙酸酯;有1个成分只存在关苍术中,为柠檬苦素;有2个成分只存在白术中,分别为(4S)-p-薄荷-1-烯-7,8-二醇 8-O-β-D-吡喃葡糖苷、atractyloside G。PCA 结果显示,四种苍术和白术药材在主成分上有较大的相似性,OPLS-DA的结果显示,关苍术和白术可各自单独聚为一类,茅苍术、北苍术和朝鲜苍术聚类一类,仍不能很好的分离,三者具有一定相似性。结论:通过对四种苍术和白术的遗传关系和化学成分研究,我们发现朝鲜苍术与北苍术具备高度的相似性,尤其是在化学成分上很明显的归为一类。关苍术在糖类成分上与茅苍术具备相似性,在薄层色谱上与白术具备相似性,气质和液质对化学成分分析的结果又单独归为一类,因此还需进行深入研究。