结肠癌是当今人类社会最常见的恶性肿瘤之一。据统计结肠癌发病率在所有肿瘤中排列第五位,而死亡率更是高居第三位,严重威胁人类的生命健康。目前结肠癌的治疗方式主要为手术治疗辅助以5-氟尿嘧啶为基础的化疗。对于中晚期结肠癌,单纯手术治疗无法去除机体内的所有肿瘤细胞,辅助全身化疗有利于清除残余肿瘤细胞,防止肿瘤复发转移,从而延长患者的生存期。5-氟尿嘧啶是各种结肠癌化疗方案中必不可少的关键药物,但临床资料显示结肠癌患者极易对5-氟尿嘧啶产生耐药。因此,如何减少5-氟尿嘧啶耐药的发生对改善结肠癌的治疗效果具有重要意义。抗氧化剂广泛存在于人们的日常饮食,保健品及药品当中。例如外科手术后常用的维生素C,维生素E,谷氨酰胺等药物均具有抗氧化剂功能。抗氧化剂能够清除体内的活性氧(reactive oxygen species, ROS),保护机体正常细胞免受由ROS攻击所致的DNA损伤,维持细胞的正常功能。研究表明各种内源性或外源性刺激可诱导体内ROS增多,持续DNA损伤引起功能基因缺失或突变,最终导致癌症发生。因此普遍认为抗氧化剂可预防肿瘤的发生发展。然而在癌症治疗过程中,多种化疗药物亦通过增加体内ROS水平,激活ROS诱导的细胞凋亡作用来杀灭癌细胞。结肠癌患者术后及化疗过程中常大量应用维生素C等抗氧化剂,但在肿瘤的药物治疗过程中应用抗氧化剂是否会对5-氟尿嘧啶耐药产生影响尚不确定,有待进一步研究。Src是人类历史上第一个被发现的原癌基因,其编码蛋白Src是一种靠近细胞膜的非受体酪氨酸蛋白激酶,与肿瘤的发生发展密切相关,据报道Src在80%结肠癌中高表达。目前Src与细胞凋亡的关系存在争议。文献报道Src可以通过激活PI3K/AKT通路,抑制下游凋亡信号的磷酸化,从而保护细胞逃避各种刺激介导的凋亡程序。Src亦可以通过直接或间接作用下调caspase-8的活性,从而抑制细胞凋亡。但另一方面,近期的多项研究显示Src促进不同药物介导的肿瘤细胞凋亡。例如在结直肠癌细胞中,抑制Src的活性可破坏阿司匹林诱导的NF-κB激活,从而抑制细胞凋亡。在乳腺癌细胞中,抑制Src的表达和活性导致eIF2α和AMPK磷酸化缺失,阻断雌激素介导的ROS产生,进而抑制细胞凋亡。Src对5-氟尿嘧啶诱导的结肠癌细胞凋亡的影响尚不确定,具体机制尚有待进一步研究。在本研究中,我们发现5-氟尿嘧啶在结肠癌细胞中通过诱导ROS生成激活Src, Src基因敲除的MEF细胞和Src基因沉默的结肠癌细胞均对5-氟尿嘧啶诱导的细胞凋亡抗性增加。我们发现Src可以与caspase-7在细胞内结合,并在多个酪氨酸位点磷酸化caspase-7。通过功能研究发现caspase-7被Src磷酸化后其活性增加,从而促进细胞凋亡。当5-氟尿嘧啶与抗氧化剂连用时,ROS介导的Src激活被阻断,导致5-氟尿嘧啶诱导的细胞凋亡减少。我们的研究首次系统的揭示了抗氧化剂减弱5-氟尿嘧啶诱导的结肠癌细胞凋亡的机制,为目前临床治疗过程中抗氧化剂趋于滥用敲响了警钟,有助于提高化疗效果,减少结肠癌患者对5-氟尿嘧啶耐药的发生率。第一章抗氧化剂减弱5-氟尿嘧啶诱导的人结肠癌细胞凋亡方法1.流式细胞仪检测联用抗氧化剂对5-氟尿嘧啶诱导的人结肠癌细胞凋亡的影响。2. Western blotting检测结肠癌细胞经抗氧化剂应用对5-氟尿嘧啶诱导细胞凋亡后PARP, caspase-3, caspase-7表达和切割的情况。3.流式细胞仪检测联用维生素C或谷胱甘肽对5-氟尿嘧啶诱导的人结肠癌细胞凋亡的影响。结果1.N-乙酰半胱氨酸(NAC)减弱5-氟尿嘧啶诱导的人结肠癌HT29细胞凋亡,过氧化氢酶减弱5-氟尿嘧啶诱导的人结肠癌SW480细胞凋亡。流式细胞仪结果显示,用NAC10mM预处理HT29细胞2h,然后与5-氟尿嘧啶50μM联用48h,HT29细胞早期凋亡率5.8%,较单用5-氟尿嘧啶48h(早期凋亡率11.6%)明显减少(P<0.001)。用过氧化氢酶200mU预处理SW480细胞2h,然后与5-氟尿嘧啶50μM联用48h,SW480细胞早期凋亡率5.5%,较单用5-氟尿嘧啶48h(早期凋亡率12.3%)明显减少(P<0.001)。2.NAC和过氧化氢酶分别与5-氟尿嘧啶联用使HT29细胞和SW480细胞凋亡信号降低。Western blotting结果显示,相比5-氟尿嘧啶单用,NAC/过氧化氢酶与5-氟尿嘧啶联用明显减弱HT29/SW480细胞内PARP, caspase-3, caspase-7等凋亡分子的切割,提示细胞凋亡率降低。3.联用维生素C或谷胱甘肽等临床常见抗氧化剂亦减弱5-氟尿嘧啶诱导的HT29细胞凋亡。流式细胞仪结果显示,用维生素C50μg/ml或谷胱甘肽40μM预处理HT29细胞2h,然后与5-氟尿嘧啶50μM联用48h,HT29细胞早期凋亡率分别为6.2%和4.9%,较单用5-氟尿嘧啶48h(早期凋亡率11.2%)明显减少(P<0.001)。第二章抗氧化剂与5-氟尿嘧啶对结肠癌细胞内R0S生成及Src活性的调控方法1. Western blotting检测过氧化氢对结肠癌细胞内Src活性的影响。2. Western blotting检测5-氟尿嘧啶对结肠癌细胞内ROS生成及Src活性的影响。3. Western blotting检测抗氧化剂与5-氟尿嘧啶联用对结肠癌细胞内ROS生成及Src活性的影响。结果1.ROS可调控人结肠癌细胞内Src的激活。Western blotting结果显示不同浓度过氧化氢处理HT29和SW480细胞30分钟后,代表ROS生成的分子标志物硫氧还蛋白过氧化物酶-3(Prx-SO3)的表达明显升高,代表Src活性的p-Src(tyr416)表达亦明显增加,并呈浓度梯度依赖。2.5-氟尿嘧啶促进人结肠癌细胞内ROS的生成及Src的激活。Western blotting结果显示5-氟尿嘧啶50μM处理HT29和SW480细胞后,Prx-SO3表达自1h开始增高,6h到达顶峰,24h仍然高表达。p-Src (tyr416)表达呈时间梯度依赖增加。3.抗氧化剂抑制人结肠癌细胞内ROS生成,且抑制5-氟尿嘧啶诱导的Src激活。Western blotting结果显示联用NAC/过氧化氢酶与5-氟尿嘧啶24h或48h均降低结肠癌细胞内Prx-SO3和p-Src (tyr416)的表达。第三章下调Src的表达抑制5-氟尿嘧啶诱导的细胞凋亡方法1.利用针对Src的shRNA包装出逆转录病毒颗粒,感染人结肠癌HT29和SW480细胞,下调Src的表达。Western blotting鉴定shRNA对Src下调的效果,同时鉴定野生型和Src基因敲除型小鼠胚胎成纤维细胞(MEF cell)内Src的表达状态。2.用不同浓度5-氟尿嘧啶分别处理对照细胞和Src低表达细胞,MTS法检测细胞对5-氟尿嘧啶的毒性反应,流式细胞仪检测细胞早期凋亡,Western blotting检测细胞内PARP, caspase-3, caspase-7表达和切割的情况。caspase-3/7活性试剂盒检测细胞内caspase-3/7的活性。结果1.用sh-Src#1和sh-Src#2包装的逆转录病毒能成功下HT29和SW480细胞中Src的表达,Src基因敲除MEF细胞中Src无表达。Western Blotting结果显示,用sh-Src#1和sh-Src#2包装的逆转录病毒感染HT29和SW480细胞,Src表达水平与对照组相比明显下降。Src基因敲除MEF细胞中Src蛋白完全无表达。2.Src低表达细胞对5-氟嘧啶敏感性降低。相比各自对照细胞,5-氟尿嘧啶对Src基因敲除MEF细胞和sh-Src结肠癌细胞的毒性减弱,诱导的细胞凋亡减少,细胞内PARP, caspase-3, caspase-7切割减少,caspase-3和caspase-7活性降低。第四章Src能够磷酸化caspase-7并在细胞内与caspase-7相结合方法1.分别在BL21和Rosetta感受肽细胞中表达野生型caspase-3, caspase-7和caspase-9蛋白。2.体外激酶反应试验检测Src能否磷酸化caspase-3与caspase-7。3.免疫共沉淀检测内源性Src与caspase-3和caspase-7的结合情况。4.免疫荧光检测Src与caspase-7的细胞内共定位。5.流式细胞仪和Western blotting法检测caspase-7表达缺失对5-氟尿嘧啶诱导的MEF细胞凋亡的影响。结果1.明确了表达caspase-3, caspase-7, caspase-9的最佳条件。表达caspase-3蛋白的最佳条件为：BL21感受肽细胞,0.5mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)25℃诱导4h。表达caspase-7蛋白的最佳条件为：Rosetta感受肽细胞,0.5mMIPTG25℃诱导4h。表达caspase-9蛋白的最佳条件为：BL21感受肽细胞,0.5mM IPTG30℃诱导1h2.Src能在体外磷酸化caspase-7,而非caspase-3。体外激酶反应试验显示用活化的Src激酶与caspase-3/7蛋白共反应,磷32放射自显影结果显示,Src和caspase-7组出现了明显的磷酸化信号,而Src和caspase-3组未出现磷酸化信号。提示了活化的Src能够在体外磷酸化caspase-7而非caspase-3o Western blotting检测Src与caspase-7反应后p-tyrosine的表达,提示Src能磷酸化caspase-7在其酪氨酸位点。3.Src能与caspase-7在人结肠癌HT29和SW480细胞内结合。在HT29和SW480细胞裂解物中免疫共沉淀caspase-3/7, Western blotting检测Src,结果显示仅caspase-7能与Src结合。4.Src能与caspase-7在SW480细胞内共定位。免疫荧光结果显示,在未处理组SW480细胞里,Src与caspase-7同时出现在细胞核和细胞质中。在5-氟尿嘧啶处理48h组,Src与caspase-7共同定位于细胞核中。5. Caspase-7基因敲除MEF细胞耐受5-氟尿嘧啶诱导的细胞凋亡。流式细胞仪结果显示,与野生型MEF细胞(48.9%)相比,5-氟尿嘧啶诱导48h后caspase-7基因敲除MEF细胞凋亡显著降低(7.6%)。Western blotting结果显示caspase-7基因敲除组细胞内PARP和caspase-3切割明显减少。第五章Sc在多个酪氨酸位点磷caspase-7并上调其活性方法1.用Netphos2.0软件预测caspase-7潜在的酪氨酸磷酸化位点。2.合成含有潜在酪氨酸磷酸化位点的肽段,体外激酶反应试验确定可被Src磷酸化的位点。3.确定caspase-7磷酸化位点后进行点突变,表达突变的caspase-7蛋白,和野生型caspase-7蛋白同时做体外激酶反应实验,验证磷酸化位点的正确性。4. Caspase-3/7活性检测试剂盒检测Src磷酸化对caspase-7活性的影响。5.分别用野生型和突变型pCMV-Myc-caspase-7质粒转染293T细胞,检测细胞内caspase-7的活性。分别用野生型和突变型pCMV-Myc-caspase-7质粒与pcDNA4-his-Src共转染293T细胞,检测细胞内caspase-7的活性。结果1. Caspase-7有9个潜在的酪氨酸磷酸化位点。Netphos2.0软件预测结果显示caspase-7有9个潜在的酪氨酸磷酸化位点可能被Src磷酸化。2.Src磷酸化caspase-7在酪氨酸58,151,229,230位点。根据预测结果合成9个肽链,分别与Src进行体外激酶反应试验。放射自显影显示酪氨酸58,151,229,230位点均能被Src磷酸化。3.突变的caspase-7蛋白被Src磷酸化的信号比野生型caspase-7蛋白明显下降。将上述4个位点全部突变为苯丙氨酸,表达出突变型caspase-7蛋白。体外激酶反应试验结果显示,与野生型caspase-7相比,四个位点突变的caspase-7蛋白被Src磷酸化的信号明显减弱。4.Src在体外上调野生型caspase-7蛋白的活性,对突变型caspase-7蛋白的活性无影响。Caspase-3/7活性试剂盒结果显示,野生型caspase-7被caspase-9激活后其活性增加。当野生型caspase-7先被Src磷酸化,再被caspase-9激活时其活性显著增加。而突变型caspase-7蛋白活性不受Src影响。5.Src在293T细胞内上调caspase-7的活性。分别用野生型和突变型pCMV-Myc-caspase-7质粒转染293T细胞,24h后用caspase-3/7活性试剂盒检测发现转染野生型质粒293T细胞caspase-7活性显著增高,而转染突变型质粒293T细胞caspase-7活性无变化。共转染caspase-7与Src,野生型caspase-7活性增高1.5倍,突变型caspase-7活性无变化。结论1.5-氟尿嘧啶通过诱导ROS生成上调结肠癌细胞内Src的活性。抗氧化剂可通过抑制ROS生成拮抗Src活性的激活。下调细胞内Src的表达和活性可抑制5-氟尿嘧啶诱导的细胞凋亡。由于抗氧化剂对Src活性的抑制作用,抗氧化剂联用可减弱5-氟尿嘧啶诱导的结肠癌细胞凋亡。2.Src在人结肠癌细胞体内可与caspase-7相结合,在多个酪氨酸位点磷酸化caspase-7并促进其活化。Caspase-7在5-氟尿嘧啶诱导的细胞凋亡中具有重要作用,其功能无法被caspase-3代偿。