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目的牙周炎是导致我国成年人失牙的主要原因,其中牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)被认为是导致牙周炎的主要致病菌。卵黄抗体(egg yolk antibodies)又称卵黄免疫球蛋白(Immunoglobulin of yolk,Ig Y),具有耐热、耐酸碱、抗酶降解能力、制备方法简便、常温亦可保存3个月等优点。同时,Ig Y作为抗体可抑制细菌的粘附、抑制细菌的酶活性和中和毒素,有研究显示抗牙龈卟啉单胞菌鸡卵黄抗体(P.gingivalis-Ig Y,P.g-Ig Y)可抑制口腔内P.gingivalis增殖。本研究首次采用油酸(Oleic acid,OA)进行抗P.g-Ig Y的制备,检测OA法制备抗P.g-Ig Y的活性和体外抑菌功能,为日后P.gingivalis的检测和治疗应用提供实验依据。方法1.P.gingivalis的免疫。BHI培养基复苏P.gingivalis ATCC 33277和毒力株W83,取单克隆菌落液体增菌48 h,通过革兰氏染色和16s RNA基因序列进行菌株检测,鉴定后的细菌用于免疫。用10 g/L的甲醛溶液灭活P.gingivalis,调节细菌浓度为1×10~9 CFU/m L作为抗原,对产蛋鸡进行4次免疫,每次间隔10 d,首次注射开始收集鸡蛋;2.Ig Y的纯化。分别采用经典方法-两步硫酸铵沉淀法(Two-step ammonium sulfate precipitation,AS)(对照组)和OA法(实验组)提纯Ig Y,直接凝集试验检测不同方法提纯后Ig Y的抗原-抗体凝集活性;3.OA法提纯Ig Y的活性检测。间接ELISA法检测不同时间点OA法提纯后Ig Y的抗体效价。SDS-PAGE电泳、Western Blot检测OA法提纯后Ig Y(40 d)的分子量大小和抗体特异性;4.OA法提纯抗P.g-Ig Y对P.gingivalis生物膜的影响。结晶紫染色法检测不同浓度OA法提纯后抗P.g-Ig Y(40 d)对P.gingivalis生物膜形成的影响;5.OA法提纯抗P.g-Ig Y对P.gingivalis入侵HPDLF细胞的影响。用P.gingivalis(MOI=50:1)入侵人牙周膜成纤维细胞(Human periodontal ligament fibroblasts,HPDLF)细胞,同时加入不同浓度的OA法提纯后抗P.g-Ig Y(40 d)共培养12 h。通过显微镜下观察、细菌染色法、平板菌落计数法检测抗P.g-Ig Y对P.gingivalis入侵HPDLF细胞的影响。结果1.OA法提纯Ig Y,21 m L卵黄可得到约190 mg的总Ig Y,较AS法产量高、实验步骤简易、耗时短。两种方法提纯的Ig Y均特异性结合P.gingivalis;2.OA法提纯的Ig Y效价高达1:10000,未免疫的Ig Y效价接近于0,后续试验均采用OA法提纯的40 d Ig Y。经过SDS-PAGE电泳和Western Blot检测,Ig Y分子量大小为180 k Da,包括65 k Da和27 k Da两条目的条带。经Western Blot检测,Ig Y特异性识别P.gingivalis,但是对毒力株W83和ATCC 33277没有特异性,与直接凝集反应检测结果一致;3.结晶紫染色结果显示,与空白对照组比较,抗P.g-Ig Y对P.gingivalis增殖和生物膜的形成具有明显的抑制作用(P<0.05),并且抗P.g-Ig Y的浓度越高对P.gingivalis形成生物膜的抑制作用越明显;4.细胞培养结果显示,与空白对照组比较,实验组培养基中可见凝集现象。通过细菌染色法和平板菌落计数法检测,与空白对照组比较,实验组均有P.gingivalis入侵HPDLF细胞(P<0.05)。随着抗P.g-Ig Y浓度增加,入侵细胞的细菌数逐渐降低。结论OA法与AS法(经典方法)比较,可简化抗P.g-Ig Y提纯步骤、缩减提纯时间,并显著提高产量;OA法提纯后的抗P.g-Ig Y能够抑制P.gingivalis增殖和生物膜形成,抑制P.gingivalis入侵HPDLF细胞。